Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление растворов и перфузионных аппаратов
- Соберите аппарат Лангендорфа с постоянным потоком (коммерчески доступный или самодельный). На рисунке 1 представлена простая схема.
- Готовьте растворы в соответствии с реагентами, приведенными в таблице 1 и таблице 2.
- Включите водяную баню и отрегулируйте подходящую температуру на входе (42,7 °C в нашей лаборатории), чтобы отток из системы циркуляции перфузата из канюли достигал 37 °C.
- Очистите перфузионную систему с помощью циркулирующей деионизированной воды. Если требуется стерильное состояние, пропустите 75% этанол через систему перфузии в течение 15 минут, а затем пропустите деионизированную воду (не менее 10 циклов, чтобы избежать воздействия алкоголя на сердце).
- Измерьте время и объем в течение одного цикла циркуляции перфузата, чтобы определить, сколько миллилитров насыщенного кислородом раствора Tyrode должно быть загружено на следующем этапе перфузии.
- Простерилизовать все хирургические инструменты нужным методом.
- Установите скорость потока перфузионной системы на уровне 4 мл/мин.
- Приготовьте две чистые 35-миллиметровые чашки Петри: одна содержит раствор Тироде (чашка Петри 1), другая — раствор 1 (чашка Петри 2).
- Приготовьте шприц, наполненный раствором 1 мл, и тупую стальную канюльную иглу массой 20 г с насечкой, от которой расстояние до кончика составляет 1 мм. Приготовьте свободный узел со швом 3-0 к стволу канюли. Отрегулируйте поле обзора стереомикроскопа и убедитесь, что наконечник канюли находится ниже поверхности жидкости чашки Петри 2.
2. Подготовка животных
- Вводите гепарин (концентрация, 1000 МЕ/мл; 0,2 мл/мышь) внутрибрюшинно, чтобы избежать образования тромбов. Через 10 минут обезболите мышей пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутримышечное введение) и убедитесь, что мыши перестают реагировать на пощипывание хвоста/пальцев ног. Вывих шейки матки выполнить через 20 минут после введения гепарина.
- Перенесите мышей на операционную платформу, зафиксируйте мышей в положении лежа на спине, простерилизуйте грудную клетку 75% этанолом и высушите ее марлей или салфеткой.
3. Иссечение сердца и канюляция аорты
- Подтяните кожу мечевидного кость с помощью тканевых щипцов и сделайте небольшой боковой разрез через кожу тканевыми ножницами. Выполните тупое рассечение между кожей и фасцией и продлите разрез кожи в V-образной форме по направлению к подмышечным впадинам с обеих сторон.
- Продолжайте тот же след разреза через грудную клетку, а затем отклоните грудную клетку вверх, зажимая грудину тканевыми щипцами, чтобы полностью обнажить сердце и легкие.
- Отклейте перикард с помощью изогнутых щипцов. Разорвите вилочковую железу в обе стороны двумя изогнутыми щипцами, если она охватывает крупные сосуды. Аккуратно потяните основание сердца к хвосту с помощью изогнутых щипцов, пока не станет виден кровеносный сосуд в форме буквы «Y» (аорта и ее ответвления).
- Чтобы зарезервировать различную длину аорты для канюляции и сравнения, пересекте аорту в левой общей сонной артерии (зеленая линия на рисунке 2) и одновременно перережьте брахиоцефальную артерию у некоторых мышей. Трансекта в восходящей аорте у других мышей (черная линия на рисунке 2).
заметка: Для тех, кто новичок в этой процедуре, этот шаг также можно проделать под стереоскопическим микроскопом.
- Удалите сердце, и сразу же погрузите в чашку Петри 1, чтобы промыть и откачать остатки крови.
- Перенесите сердце в чашку Петри 2 и при необходимости обрежьте излишки ткани тонкими ножницами для ириса. Для тех, кто новичок в этой процедуре, проделайте этот шаг под стереомикроскопом, чтобы избежать ошибочного разрезания аорты или других структур сердца.
- Нажмите на шприц, чтобы удалить пузырьки воздуха перед канюляцией аорты. Выполните ретроградную канюляцию аорты с помощью двух прямых связующих щипцов (гладких губок) под стереомикроскопом. Убедитесь, что весь процесс канюляции находится под поверхностью жидкости.
- Избегайте проникновения аортальных клапанов и отрегулируйте глубину до восходящей аорты (у мыши, у которой аорта была пересечена на левой общей сонной артерии) и корня аорты (у мыши, у которой аорта была пересечена на восходящей аорте) соответственно.
заметка: Глубина канюляции аорты (называемая просто глубиной) определяется здесь как положение, в котором кончик канюли находится в аорте или где аорта перевязана.
- Перевязать аорту с помощью предварительно узелкового шва 3-0 до выемки канюли. Аккуратно нажмите на содержимое шприца, чтобы смыть остатки крови.
заметка: Кровь будет покидать коронарные артерии и вытекать из дорсальных вен, если глубина расположена правильно. Сердце и придатки предсердий расширяются и становятся бледными.
- Снимите и подсоедините канюлю к аппарату Лангендорфа. Еще раз следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не попадали в сердце.
заметка: Следует иметь в виду, что время от торакотомии до первичной перфузии не должно превышать 5 минут.
- Для перфузии сердца сначала заправляют и перфузируют насыщенный кислородом раствор Тайрода примерно на 10 с (объем жидкости, работающей 10 с в системе, используемой в данном протоколе, составляет примерно 0,7 мл) при наличии остаточной крови в предсердиях, а затем переходят на раствор 1. Однако просто проведите перфузию раствором 1, если в предсердиях нет остаточной крови. Перфузируйте сердце примерно на 2 минуты.
Таблица 1. Решения для изоляции КМ взрослой мыши.
| решение | Содержание (конечная концентрация в ммоль/л, если не указано иначе) | знаменитый |
| Перфузионный раствор (раствор 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 таурин, 5 глюкоза, 10 моноксим 2,3-бутандиона (BDM) | Который может храниться в течение 3 дней при 4 °C. Глюкоза, таурин и BDM добавляются в день эксперимента. Приготовьте по 200 мл перфузионного раствора для каждого сердца. |
| Решение Тайроде (решение 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 глюкоза | Который может храниться в течение 3 дней при 4 °C. CaCl2 и Glucose добавляют в день эксперимента, регулируют pH до 7,3-7,4 с насыщенным NaOH при комнатной температуре (28-30°C) с помощью PH-метра. |
Таблица 2. Решения для изоляции и хранения КМ взрослой мыши.
| решение | содержание | знаменитый |
| Раствор для сбраживания (раствор 3) | 25 мл раствора 1, 6 мкл 100 мкм/л CaCl2, 25 мг коллагеназы II, 50 мкл (2,5 % 10×) трипсина | Для каждого сердца |
| Остановка решения 1(решение 4) | 9 мл раствора 1, 1 мл FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота), 4 мкл 100 мМ/л CaCl2 | Для каждого сердца |
| Стоп решение 2(решение 5) | 9,5 мл раствора 1, 0,5 мл FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота), 4 мкл 100 мкм/л CaCl2 | Для каждого сердца |
| Решение для ресуспендирования клеток (раствор 6) | 13 мл раствор 1, 7 мкл 1М/л CaCl2, BSA (бычий сывороточный альбумин) в дозе, которая может образовывать тонкий слой, покрывающий поверхность жидкости | Для каждого сердца |
