$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка перед выделением клапанных клеток у взрослых мышей
- Очистите и простерилизуйте все хирургические инструменты, показанные на рисунке 1A, используя 70% v/v этанола, а затем автоклавируйте их в течение 30 мин. Очистите хирургическое рабочее место 70% этанолом.
- Добавьте 500 мкл пенициллин-стрептомицина к 50 мл 10 мм HEPES. Приготовьте аликвоту из 50 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Держите растворы на льду.
- Приготовьте растворы коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл и используйте по 5 мл каждого раствора в 15 мл пробирок для выполнения всей процедуры. Для приготовления 5 мл 1 мг/мл коллагеназы смешайте 5 мг коллагеназы с 2,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM, без фетальной бычьей сыворотки (FBS)) и 2,5 мл 10 мл 10 мг HEPES с добавлением антибиотиков (1% пенициллин-стрептомицин из этапа 1.2). Отфильтруйте растворы через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить загрязнения.
заметка: Держите растворы на льду, чтобы защитить ферменты.
- Нагрейте раствор DMEM до 37 °C перед использованием во всех описанных ниже шагах. Приготовьте готовую среду, добавив DMEM 1% пенициллин-стрептомицина, 1% пирувата натрия, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 мл реагента для элиминации микоплазмы (см. Таблицу материалов) и 10% FBS.
2. Изоляция клапанных ячеек
- Чтобы получить 106 клеток для эксперимента, используют пять 8-недельных мышей (минимум три). Поместите мышь в индукционную камеру вместе с небольшим кусочком папиросной бумаги, смоченным в 1 мл изофлурана, но не допускайте контакта с тканью. Подтвердить, что животное полностью обезболито; Проверьте наличие рефлекса защемления пальца ноги, а затем усыпьте мышь при шейном вывихе. Используйте изофлуран для облегчения боли до вывиха шейки матки, так как описанная ниже процедура является терминальной.
- Поместите мышь на препарирующую платформу, а лапы зафиксируйте канюлями, чтобы удержать ее на месте. Очистите грудь и брюшную полость этанолом; Раскройте живот и грудную клетку ножницами. Маленькими хирургическими ножницами разрежьте между левым предсердием и левым желудочком, чтобы обескровить мышь. Перфузируйте сердце 10 мл холода 1x PBS, чтобы удалить кровь из сердца.
- Разрежьте сердце и держитесь на расстоянии 3 мм от восходящей аорты, как показано на рисунке 1B. Рассеките аортальный клапан под стереомикроскопом. Разрежьте сердце горизонтально посередине желудочков (рисунок 1В). Разрежьте левый желудочек по направлению к аорте и осторожно рассеките аортальный клапан (рисунок 1D-F). Соедините клапаны вместе в небольшой чашке для культуры тканей диаметром 35 мм.
- Промойте выделенные клапаны в чашке для клеточных культур диаметром 75 мм 5 мл холодного HEPES (10 мМ) с добавлением антибиотиков (1% пенициллин-стрептомицина) для удаления крови (Рисунок 2). Приготовьте две пробирки по 15 мл коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл, как описано выше в шаге 1.3.
заметка: После вскрытия манипулируйте изолированными клапанами в стерильном биозащитном колпаке, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Инкубировать клапаны в коллагеназе I типа (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием (рис. 2). Центрифугируйте пробирку в течение 5 мин при 150 × г, промойте гранулу один раз 2 мл HEPES (10 мМ) и перемешайте в течение 30 с на высокой скорости. Высыпьте содержимое этой пробирки в чашку для культуры диаметром 35 мм, а фрагменты ткани с помощью тонкого пинцета аккуратно перенесите в новую пробирку.
заметка: На этой стадии ВИК еще не диссоциированы от ткани, а гранула содержит кусочки ткани. Во избежание контаминации эндотелиальными клетками не следует центрифугировать после вортексирования на этапе 2.5.
- Инкубируйте гранулу в пробирке объемом 15 мл с 5 мл коллагеназы типа I (4,5 мг/мл) при 37 °C при непрерывном перемешивании в течение 35 мин. Повторно суспендируйте клетки пипеткой объемом 1 мл для разделения клеток и центрифугируйте при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в 2 мл полного DMEM. Центрифугируйте при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды><, чтобы очистить ячейки.
заметка: В грануле все еще будут присутствовать фрагменты ткани.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл готовой среды и поместите клетки в одну лунку 6-луночной чашки для культивирования клеток в минимальное количество среды, чтобы облегчить их прикрепление к чашке для культивирования. Оставьте клетки в покое в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% углекислого газа.
- Через 3 дня проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в хорошем росте вблизи остатков тканей. Как только под микроскопом будет видна 1000 клеток, осторожно удалите остатки ткани с помощью автоклавного пинцета и смените среду.
заметка: Плиту нельзя тревожить; Если нужного количества клеток не наблюдается, поместите чашку для клеточной культуры обратно в инкубатор еще на 2 дня.
