$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Приготовление раствора метиленового синего красителя
- Отмерьте 0,1 г порошка метиленового синего.
- Растворите метиленовый синий в 10 мл нормального физиологического раствора или в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) путем вортексирования.
- Отфильтруйте раствор метиленового синего 10 мг/мл с помощью шприцевого фильтра (размер пор мембраны 0,45 мкм) для устранения засорения во время инъекции.
- Соберите стерильный набор для изучения вен кожи головы (27 г x 3/4 дюйма) с одноразовым шприцем объемом 3 мл и наполните шприц 3 мл фильтрованным раствором метиленового синего><.
заметка: Чтобы предотвратить гидростатическое давление и последующий поток красителя, поместите кончик иглы над шприцем, заполненным раствором метиленового синего.
2. Вскрытие пренатальных эмбрионов
- Очистите ножницы и щипцы для препарирования 70% этанолом.
- Чтобы собрать перинатальные эмбрионы в точке E18.5 или E19.5, сначала усыпьте беременных мышей с помощью ингаляции CO2, а затем выполните вывих шейки матки в соответствии с рекомендациями NIH><.
заметка: Беременная самка мыши обычно рожает, начиная с E18.5, однако более крупными почками легче манипулировать. Поэтому почкам на Е19,5 ближе к роду легче провести этот анализ. Однако детеныши с двусторонней обструкцией мочевыводящих путей умирают после рождения. В зависимости от особенностей подопытных мышей следует эмпирически определить подходящий день/время сбора.
- Распылите 70% этанол на вентральную поверхность брюшной полости, а затем откройте брюшную полость вентрально с помощью ножниц и щипцов.
- Приподнять всю матку и отделить ее от тела, разрезав ножницами-препарантами на кончиках маточных рогов.
- Промойте всю матку 1x PBS в чашке Петри.
- Разрезать матку сегментарно с помощью пресекающих ножниц и удалить плацентарный децидуал с помощью рассекающих щипцов, чтобы обнажить эмбрионы в желточных мешках.
- Сначала удалите желточный мешок, а затем удалите амниотическую оболочку с помощью рассекающих щипцов, чтобы освободить перинатальные эмбрионы.
- Обезглавьте эмбрион ножницами для препарирования. Вытрите лишнюю кровь стерильными марлевыми салфетками. Прижмите эмбрион вентральной поверхностью вверх к препарирующему микроскопу, оснащенному цифровой камерой для визуализации. При необходимости соберите его хвост для генотипирования.
заметка: Выполняйте инъекции по одному эмбриону за раз.
- Осторожно вскройте брюшную полость эмбриона с помощью щипцов, разорвав кожу. Затем осторожно удалите лишние органы и ткани, такие как печень, желудок и кишечник, с помощью щипцов, разрезав или вытащив, чтобы обнажить почки, мочеточники и мочевой пузырь, расположенные дорсально (рисунок 1A). При необходимости абсорбируйте излишки крови из вскрытого эмбриона стерильными марлевыми салфетками.
заметка: Избыток крови препятствует идентификации почечной лоханки для инъекции красителя.
3. Инъекция метиленового синего красителя в почечную лоханку и контроль потока красителя
- Удалите пузырьки в игле и трубке, выдавливая раствор метиленового синего с кончика иглы под действием гидростатического давления. Поднимите шприц, содержащий раствор красителя, над уровнем кончика иглы, чтобы начать поток, а затем опустите шприц, чтобы остановить поток.
- Введите иглу в почечную лоханку рядом с проксимальным отделом мочеточника, стараясь не потревожить его после размещения. Выполните инъекцию красителя в почку, чтобы определить ее обструкцию мочевыводящих путей.
заметка: Выполните инъекцию красителя в любую патологическую почку, сначала следуя тому же способу, чтобы определить ее обструкцию мочевыводящих путей.
- Поднимите шприц вверх примерно на 20 см, чтобы обеспечить гидростатическое давление, и дайте течь 15–60 μл раствора красителя. Скорость потока составит около 3 мкл/с, если шприц поднять на эту высоту над эмбрионом.
- Следите за синим цветом красителя, начиная сначала с почечной лоханки, затем по длине мочеточника и, наконец, в просвете мочевого пузыря.
заметка: Требуется около 5 секунд, чтобы увидеть, как слабый цвет красителя появляется в просвете мочевого пузыря, если мочеточник правильно вставлен в мочевой пузырь. Дайте красителю накопиться в заблокированном месте около 15 с, если в просвете мочевого пузыря не появляется краситель.
- Опустите шприц вниз, чтобы остановить поток красителя и извлечь иглу из почки.
- Сделайте снимки почки, мочеточника и мочевого пузыря, прослеженные раствором красителя, с помощью камеры и программы визуализации, подключенной к стереомикроскопу.
- Запишите гидронефроз почки, гидромочеточника и конечное положение раствора красителя в лабораторную тетрадь.
- Выполните инъекцию контралатеральной почки, как описано в шагах с 3.1 по 3.5, и дайте красителю течь в общей сложности около 20 с.
заметка: Просвет мочевого пузыря будет заполнен раствором красителя, обозначенным сильным синим цветом, если мочеточник правильно введен в просвет мочевого пузыря. После оценки обструкции соединения мочевыводящих путей мочеточники и мочевой пузырь могут быть зафиксированы для секции.
