Изоляция яичников неонатальной мыши: хирургическая процедура забора пары яичников у неонатальной модели мыши

Аннотация

Источник: et al. Morgan, S. Культура и совместное культивирование яичников мышей и фолликулов яичников. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео мы описываем хирургическую процедуру по выделению яичников у неонатальной мыши.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Диссекция и культура яичников новорожденных

1. Поместите 1 мл среды для вскрытия (растворите 3 мг/мл BSA в среде Leibowitz L15 и процедите стерилизовать через фильтр диаметром 0,2 мкм и диаметром 25 мм) в каждую стерильную стеклянную чашку для эмбрионов.
2. Выбраковка новорожденных мышей в возрасте от 0 до 5 дней после рождения, выбраковка путем обезглавливания.
3. Захватите кожу, покрывающую брюшную стенку, с помощью пары тонких щипцов для рассечения и сделайте большой разрез на коже и стенке тела. Раскройте разрез так, чтобы была открыта вся брюшная полость. На этой стадии мочевой пузырь обычно набухает и может быть проколот, чтобы облегчить расслоение.
4. Отодвиньте кишки в сторону с помощью щипцов для часов. Проследите за рогами матки от мочевого пузыря до почек с каждой стороны. Яичник расположен чуть ниже почки в верхней части матки и будет выглядеть как облачная структура под микроскопом.
5. Осторожно обхватите яичник часовыми щипцами и ножницами разорвите его прикрепление к матке. Переложите пару яичников в чашки для эмбрионов, содержащие предварительно подогретую среду для вскрытия.
6. Провести тонкую диссекцию яичников под диссекционным микроскопом на нагретом предметном столике (37 °С). Используйте иглы инсулина, чтобы обрезать бурсальный мешок и любой лишний материал, включая фаллопиеву трубу, пока не останется только яичник.
7. Перенесите каждую завязь в лунку культурального планшета с помощью тонко нарисованной изогнутой стеклянной пипетки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лейбовиц L15	Инвитроген	11415049
αMEM	Инвитроген	22571020	Поставляется в виде бикарбоната натрия с буферизацией (2 200 мг/л)
Бычий сывороточный альбумин	Сигма Олдрич	А9418	Для диссекционной среды
Бычий сывороточный альбумин	Сигма Олдрич	А3311	Для питательных сред
Бычий сывороточный альбумин	Сигма Олдрич	А2153	Для покрытия стеклянных пипеток
Фсг	Мерк Сероно	Гонал Ф	Часто необходимо проводить пакетное тестирование. Восполните исходный раствор 1МЕ/10 мкл в αMEM и храните при -20 °C
Шприцевые фильтры (25 мм, 0,2 мкм)	Грейнер	16532К	Фильтр из ацетата целлюлозы для фильтрации больших (>5 мл) объемов среды.
Стерильные пробирки	Грейнер	187261
24-луночный планшет	Грейнер	Номер 662160
Иглы для инсулина	Медицинские принадлежности BD	037-7606 (Английский	0,33 мм (29 G) + 1 мл
Стеклянные зародыши посуды	ВВР	720-0579 (Английский)	Стерилизовать, затем согреть перед использованием
Стеклянные пипетки	Научный центр Фишера	10209381	Покрытие BSA перед использованием
Акупунктурные иглы	ООО «Акумедик»	30 мм x 0,25 Type C
Раствор формалина, нейтральный буферный, 10%	Сигма Олдрич	HT5014-120mL
Нуклеопорные мембраны ватмана	Камлаб	WN/110414	Используйте блестящую поверхность вверх, поликарбонат, диаметр 13 мм, размер пор 8,0 μм

)