$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные
- Содержание взрослых самок мышей в возрасте от 3 до 6 недель в помещении с контролируемой температурой и влажностью (с фазами 12L:12D и кормлением ad libitum).
- Вводите мышам внутрибрюшинно 2,5 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG) для стимуляции роста фолликулов путем имитации эффектов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Изолируйте яичники для сбора антральных ооцитов через 48 ч. Усыпьте самку мыши, которой ранее вводили PMSG, в соответствии со стандартными рекомендациями.
- Быстро извлеките яичники из полости тела и поместите их в чашку Петри, содержащую среду М2, для последующей изоляции ооцитов (см. раздел 3).
- Сделайте разрез на коже, покрывающей брюшную стенку, с последующим разрезом в брюшине с помощью стерильных ножниц для рассечения. Откройте разрез, чтобы обнажить брюшную полость, переместите кишки с одной стороны с помощью стерильного пинцета и локализуйте маточные трубы, образуя V-образную форму, начиная от мочевого пузыря.
- Понаблюдайте за яичниками, расположенными ниже почек. Придерживайте каждую трубку стерильным пинцетом и сделайте небольшой разрез в нижней части яичников, чтобы освободить их. Переложите оба яичника на дно чашки Петри, содержащей предварительно уравновешенную среду.
2. Гормональный препарат
- Разбавьте PMSG (выпускается в различных исходных концентрациях) стерильным изотоническим физиологическим раствором до получения рабочей концентрации гормона 2,5 МЕ на 0,1 мл для соответствующего объема инъекций. <бр/>
заметка: Гормональные растворы должны быть аликвотированы в пробирках объемом 0,5 мл и храниться при температуре -20 °C до дня использования. Не храните разведенные аликвоты дольше трех месяцев при температуре -20 °C. После размораживания, если выполняются серийные инъекции, храните аликвоты гормональных растворов при температуре +4 °C и используйте их в течение 4 дней.
3. Выделение антральных ооцитов
Для правильного выделения ооцитов:
- Уравновесьте среду М2 (М2) при 5%CO2 и 37 °C в течение не менее 1 ч до начала процедуры выделения ооцитов. Приготовьте две чашки Петри (35 мм х 10 мм), одну с 1 мл М2 для прокола яичников, а вторую с небольшими каплями (20 мкл) М2, покрытыми минеральным маслом (~1,5 мл) для переноса ооцитов после выделения из яичника (см. шаги 3.4–3.6). Держите обе чашки Петри в инкубаторе при 5%CO2 и 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
- Используйте стереомикроскоп во время процедур выделения ооцитов.
- Подготовьте стеклянные пипетки с тонким горлышком для сбора ооцитов, растягивая стеклянные пипетки Пастера, расположенные горизонтально (держа концы пипетки обеими руками), над вертикальным пламенем, исходящим от горелки Бунзена (рис. 1).
- Как только стекло начнет плавиться, выньте пипетку из пламени и выполните быстрое тянущее движение, чтобы получить желаемую пипетку. Плотно срежьте лишнее стекло вплотную к узкому кончику пипетки ногтями, чтобы отрегулировать длину и диаметр внутреннего капилляра. Убедитесь, что внутренний диаметр тонкого капилляра составляет ~100 мкм, что немного больше диаметра ооцита (~80 мкм).
- Чтобы открыть пипетку в рот, подсоедините один конец аспираторной трубки к вытянутой пипетке с помощью подходящего наконечника, а другой конец поместите в рот, закрепив его зубами.
- Соберите яичники с помощью стерильного пинцета и положите их на дно чашки Петри для клеточной культуры (35 мм х 10 мм). Налейте на них 1 мл M2, предварительно уравновешенного при 37 °C и 5%CO2 (рис. 2).
- Аккуратно проколите антральные фолликулы яичников стерильной иглой инсулинового шприца, чтобы высвободить антральные ооциты в М2 (рисунок 3).
- Осторожно проведите пипетку через узкую пипетку Пастера через пипетку Пастера, чтобы удалить клетки фолликула и любые другие возможные остатки тканей (рисунок 4А), а затем отложите их на дно небольших капель (20 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, пригодным для культивирования эмбрионов (предварительно подготовленных; Рисунок 4B).
заметка: Важно удалить все кучевые клетки, прикрепленные к пеллюцидной зоне ооцитов, путем непрерывного пипетирования через несколько разных капель М2. Выполните этот шаг как можно быстрее, чтобы избежать изменений pH среды.
