$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Двойные инъекции смолы
- подготовка
- Приготовьте раствор смолы. Для двойных системных инъекций смолы приготовьте желтую и зеленую смолы, как описано в шагах 1.1.2-1.1.4.
- Приготовьте по 1 мл разбавленной смолы на одну мышь.
- Желтая смола: Разбавьте желтый силиконовый каучук (с высокой рентгеноконтрастностью) прозрачным разбавителем в соотношении 3:1 для подготовки желтой смолы для инъекций.
- Зеленая смола: Смешайте синий силиконовый каучук (неопределяемая рентгеноконтрастность) с прозрачным разбавителем в соотношении 1:1 для получения синей смолы. Чтобы получить зеленую смолу, смешайте разбавленную синюю смолу с разбавленной желтой смолой в соотношении 1:1. Тщательно смешайте зеленую смолу до однородного цвета.
заметка: Синяя смола имеет очень низкую рентгеноконтрастность, которая не обнаруживается с помощью микрокомпьютерной томографии, что требует разбавления желтой смолой для создания двух смол с разной рентгеноконтрастностью.
осторожность: Смола может содержать хромат свинца, который является канцерогеном. Он выделяет ядовитые газы при пожаре. Обращайтесь осторожно и утилизируйте смолу как опасные отходы.
- Подготовьте два набора для впрыска (набор для впрыска #1 и набор для впрыска #2) с трубками, как описано в шагах 1.1.6-1.1.11.
заметка: Для взрослых мышей (>P30 (30-й день после рождения) = P30 - 2 года) используйте инъекционный набор #1 (трубка PE10 с наружным диаметром 0,6 мм) для инъекции в общий желчный проток и инъекционный набор #2 (трубка PE50 с наружным диаметром 0,96 мм) для инъекции в воротную вену. Для молодых постнатальных мышей (до P30) приготовьте два набора для инъекций #1, один для желчного протока и один для инъекции в воротную вену (набор для инъекций #2 не используется, так как воротная вена слишком узкая для размещения трубки PE50).
- Чтобы подготовить набор для инъекций #1, отрежьте 30 см трубки PE10 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет как можно тоньше (рис. 1A,B, диаметр примерно 0,15 мм, нерастянутая трубка PE10 диаметром 0,6 мм).
- Разрежьте кончик растянутой трубки PE10 по диагонали, чтобы получился скошенный кончик (Рисунок 1B).
- Подсоедините нерастянутый конец трубки PE10 к игле 30 G (Рисунок 1A, Набор для инъекций #1).
- Чтобы подготовить набор для инъекций #2, отрежьте 30 см трубки PE50 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет достаточно тонким, чтобы войти в воротную вену (рис. 1A,B, примерно 0,7 мм, нерастянутая трубка PE50 имеет диаметр 0,96 мм).
- Разрежьте кончик растянутой трубки PE50 по диагонали, чтобы получился скошенный кончик (Рисунок 1B).
- Подсоедините нерастянутый конец трубки PE50 к игле 23 G (Рисунок 1A, набор для инъекций #2).
заметка: Каждый набор для инъекций можно использовать только для одной инъекции, так как смола затвердевает в шприце и трубке. Отрегулируйте размер вытянутого и скошенного кончика в зависимости от размера общего желчного протока и воротной вены мыши в зависимости от ее возраста, генотипа и фенотипа. Если вы не уверены в размере и посадке трубки, вставьте трубку в соответствующий проток или сосуд после разреза и до того, как трубка будет заполнена смолой. Если трубка слишком широкая, чтобы поместиться в воздуховод/сосуд, растяните ее дальше.
- Обезболить животное путем ингаляции изофлураном (сначала 4% в индукционной камере и ~2% с помощью носового конуса).
- Поместите мышь на проветриваемую скамейку на диск для вскрытия, пока мышь вдыхает изофлуран через носовой конус. Убедитесь, что животное находится в бессознательном состоянии, с помощью метода, рекомендованного институтом/IRB, например, ущипнув одну из лап.
осторожность: Изофлуран может вызывать сонливость или головокружение при вдыхании и может вызвать повреждение сердечно-сосудистой системы и центральной нервной системы при длительном или повторном воздействии. Не вдыхайте его. Работайте с веществом на проветриваемом столе и в хорошо проветриваемых помещениях.
заметка: Возможно использование и другого метода обезболивания, главное, чтобы он был совместим с перфузией сердца.
- Когда животное потеряет сознание, распылите на брюшную сторону 70% этанола, чтобы предотвратить попадание шерсти
на него.
- С помощью ножниц для кожи разрежьте кожу, фасцию и мышечный слой, начиная со средней линии брюшной полости и прорезав до грудной полости, чтобы обнажить внутренние органы.
- Захватите мечевидный отросток щипцами, чтобы поднять грудину, и разрежьте диафрагму и грудную клетку с обеих сторон, чтобы обнажить сердце и легкие.
- Удалите грудную клетку, разрезав ножницами ребра с левой и правой стороны грудной клетки. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить печень, так как это приведет к утечке смолы.
- С помощью прямых щипцов подтяните сердце к печени и отрежьте правое предсердие.
- Введите иглу-бабочку (23 г), соединенную с перистальтическим перфузионным насосом, в левый желудочек. Перфузируйте мышь транскардиально сбалансированным раствором соли Хэнкса (HBSS) и гепарином (1 ед/г массы тела мыши). Перфузия в течение 3 мин со скоростью перфузии 5 мл/мин.<бр/>
заметка: Если мышь перфузируется правильно, внутренние органы станут бледными, особенно печень. Если вместо этого легкие становятся белыми, игла вводится в правый желудочек и ее следует переместить. После перфузии мышь обескровливается и может быть удалена из носового конуса и изофлурана.
- Выключите изофлурановую помпу.
2. Литье смолы в желчевыводящую систему
- Переместите мышь к диссекционному микроскопу, брюшком вверх, хвостом к экспериментатору и головой отойдите от экспериментатора. Интересующие нас анатомические ориентиры изображены на рисунке 2А.
- Найдите нижнюю полую вену (рисунок 2A), сдвинув кишечник в сторону. С помощью пружинных ножниц сделайте небольшой поперечный разрез в нижней полой вене, чтобы обеспечить сброс печеночного сосудистого давления (Рисунок 2Bi).
- Обнажите общий желчный проток и воротную вену, как описано в шагах 1.2.4-1.2.6.
- Переместите кишечник и поджелудочную железу в правую сторону (от экспериментатора) с помощью ватного тампона, смоченного фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Переверните вентральную сторону печени к сердцу с помощью ватного тампона, смоченного в PBS, чтобы обнажить висцеральную поверхность и прикорневую область.
- Найдите общий желчный проток, который проходит от прикорневой области через поджелудочную железу в кишечник у сфинктера Одди (Рисунок 2Bii, общий желчный проток обведен желтой пунктирной линией, черные стрелки указывают на сфинктер Одди).
заметка: Убедитесь, что печень влажная на протяжении всей процедуры, посыпав ее PBS.
- Очистите окружающие ткани (площадь ~5 мм) от общего желчного протока с помощью прямых щипцов. Поместите шелковую шовную нить (размер 4-0, 0,17 мм, длина 3-5 см) под общий желчный проток (Рисунок 2Bii) и завяжите свободный верхний узел вокруг общего желчного протока (Рисунок 2Biii).
заметка: Выберите участок для узла на полпути между прикорневой областью и сфинктером Одди и на некотором расстоянии от воротной вены так, чтобы после затягивания шва вокруг общего желчного протока он не мешал введению в воротную вену.
- Прижмите пружинные ножницы к общему желчному протоку, чтобы сделать косой разрез общего желчного протока в том месте, где общий желчный проток входит в поджелудочную железу и кишечник рядом со сфинктером Одди. (Рисунок 2Biv), желтая пунктирная линия очерчивает сфинктер области Одди, подчеркнутая черными стрелками).
заметка: Это ответственный шаг. Сделайте косой, а не поперечный надрез, и сделайте надрез; Не стоит разрывать желчный проток. Разрезание всего желчного протока делает введение трубки очень сложным.
- Непосредственно перед применением смешайте 1 мл желтой смолы с 50 мкл отвердителя (путем наполнения и опорожнения шприца объемом 1 мл) и наполните шприц Люэра 1 мл смесью отвердителя смолы.
- Подсоедините наполненный шприц к трубке (набор #1). Нажмите на поршень, чтобы полностью заполнить трубку. Убедитесь, что смесь смолы и отвердителя стекает с кончика трубки.
заметка: Избегайте и удаляйте пузырьки в шприце и трубке для достижения наилучших результатов.
- С помощью щипцов выпрямите область вокруг разреза общего желчного протока и вставьте трубку в отверстие в общем желчном протоке (рис. 2Bv) самым длинным краем скошенного кончика вниз к тыльной стороне желчного протока. Такая ориентация гарантирует, что смола может выйти из отверстия трубки, которое обращено вверх, в воздуховод (Рисунок 2Bv).
- Затяните узел шелковой нити, чтобы закрепить трубку внутри общего желчного протока (рисунок 2Bvi).
- Введите смолу в общий желчный проток. Понаблюдайте за желчным пузырем и отдельными долями печени.
- Помассируйте печень ватным тампоном, смоченным в PBS, чтобы смола равномерно распределилась. На поверхности печени слабо заметны концевые ветви желчных протоков, заполненные смолой (у мышей дикого типа).
заметка: Ожидаемое время наполнения печени составляет 30-100 с.
- Прекратите инъекцию смолы, когда на поверхности печени появляются точки смолы (рис. 2Ci, синие стрелки) или при достижении сопротивления.
заметка: Работайте как можно быстрее, так как смола начинает затвердевать после добавления отвердителя смолы. Рабочее время с момента добавления отвердителя составляет около 15 минут.
- Снимите трубку, вытащив ее из общего желчного протока, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы смола не вытекала наружу. Срежьте свободные концы шелкового шва, чтобы они не мешали введению в воротную вену.
- Выбросьте трубку, содержащую смолу, и остатки смолы в опасные отходы, а иглу - в отходы острых предметов.
