Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Рассечение синоатриального узла (SAN)
- Приготовьте гепаринизированный раствор Complete Tyrode's для диссекции САН.
- Добавьте 400 мкл гепарина (1000 USP/мл) в 40 мл раствора Complete Tyrode и подогрейте на водяной бане при температуре 37 °C.
- Введите мышке внутрибрюшинно 200-300 мкл гепарина (1000 USP/мл) и дайте животному посидеть 10 минут.
- Усыпите гепаринизированную мышь путем передозировки изофлурана.
- Поместите мышь в небольшую стеклянную камеру, содержащую пары изофлурана, образующиеся при добавлении 200-300 мкл жидкого изофлурана в фильтровальную бумагу внутри перфорированной пластиковой трубки><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку изофлуран может вызывать раздражение кожи, а также может всасываться через кожу, жидкость не должна контактировать с мышью напрямую. Поэтому пропитанную изофлураном салфетку помещают в перфорированную трубку для введения.
- Констатируйте смерть по прекращению движений и дыхательных усилий, а также по отсутствию рефлекса щипкового рефлекса на пальцах ног. Смерть обычно наступает через 1-2 минуты после помещения в камеру.
заметка: Смерть обычно сопровождается позывом к мочеиспусканию.
- Поместите мышь в лежачем положении на доску для вскрытия с вытянутыми лапами и прикрепите лапы к доске с помощью игл для шприцев 23-го калибра длиной 1 дюйм. Затем удалите мех в непосредственной близости от дна грудной клетки с помощью хирургических ножниц и срезайте мех у корней.
заметка: Для платы для вскрытия можно использовать крышки холодильников из полистирола.
- Удерживая кожу гемостатом, хирургическими ножницами сделайте поперечный разрез на коже чуть ниже нижней части грудной клетки примерно от левой реберной дуги до правой реберной дуги (рисунок 1A).
- Разрежьте брюшину хирургическими ножницами и осторожно отделите печень от диафрагмы, стараясь не повредить печень, что вызовет чрезмерное кровотечение (рисунок 1B). Надрежьте диафрагму вдоль грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость (рисунок 1C-D).
- С помощью хирургических ножниц разрежьте боковые стенки грудной клетки от краев реберных дуг до ключиц, чтобы обнажить сердце, стараясь не повредить сердце (рисунок 1D). Затем с помощью иглы шприца 23-го калибра приколите грудную клетку через плечо, удерживая ее на месте и подальше от операционного поля.
- С помощью переводной пипетки капните теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode's на сердце, чтобы оно оставалось влажным.
заметка: Не допускайте пересыхания сердца.
- Удалите легкие, удерживая их очень тонкими щипцами Graefe и разрезав трахею хирургическими ножницами (рисунок 1E).
- Удерживайте верхушку сердца очень тонкими щипцами Грефе и удалите ее, разрезав аорту и полые вены хирургическими ножницами. Перенесите сердце в чашку Петри, содержащую отвержденный силиконовый эластомер (рис. 2A) и с помощью пипетки для переноса промойте сердце 2-3 мл теплого (37 °C) гепаринизированного раствора Complete Tyrode><.
заметка: Будьте осторожны, чтобы не повредить нежную заднюю стенку правого предсердия, в котором находится SAN, и соединенные вены правого предсердия. Купание сердца раствором Complete Tyrode предотвращает высыхание сердца, но не погружайте сердце полностью в раствор, так как это ухудшит видимость во время вскрытия.
- Ориентируйте сердце так, чтобы правое предсердие находилось справа от экспериментатора, а левое предсердие — слева от экспериментатора.
заметка: Диссекция ткани САН должна быть выполнена быстро, чтобы предотвратить повреждение, связанное с ишемией.
- Приложите верхушку сердца к блюду с помощью рассекающего штифта. Затем, удерживая нижнюю полую вену щипцами для ламинэктомии Dumont #2, введите иглу шприца 22 G через нижнюю и верхнюю полую вену, чтобы определить их положение в правом предсердии, что также определяет приблизительное положение SAN (расположенного на участке ткани между нижней и верхней полыми венами (рис. 2B).
- С помощью небольших рассекающих штифтов приколите левый и правый предсердные придатки к посуде.
- Удерживая ушок левого предсердия щипцами для ламинэктомии Dumont #2, вставьте диссекционный штифт через ушок левого предсердия, чтобы удержать его на месте.
- Удерживая правый ушок предсердия щипцами Dumont #55, вставьте рассекающий штифт через правый придаток предсердия, чтобы удержать его на месте.
заметка: При желании этот же тип щипцов можно использовать для удержания ушков левого и правого предсердия.
- Извлеките иглу шприца, которая охватывает полые вены.
- Чтобы выпустить кровь из сердца, с помощью ножниц Кастровьехо удалите верхушку сердца (т. е. нижнюю половину), сделав поперечный разрез поперек желудочков (Рисунок 2C). Затем промойте сердце, добавив теплый (37 °C) гепаринизированный раствор Complete Tyrode's с помощью переводной пипетки.
- Используйте ножницы Кастровьехо для разреза вдоль атриовентрикулярной перегородки, сохраняя разрез ближе к желудочку, чем предсердия. Продолжайте разрез вдоль атриовентрикулярной перегородки до тех пор, пока предсердия не отделятся от желудочков.
- Разрежьте вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие.
- Поместите рассекающие штифты на периферию правого предсердия так, чтобы оно лежало ровно (Рисунок 2D). Удалите оставшийся жир, сосуды или ткани из предсердия с помощью ножниц Castroviejo.
- Расположите SAN в правом предсердии, которое в этой ориентации примерно граничит с верхней полой веной (сверху), нижней полой веной (снизу) и cristae terminalis (слева) (рис. 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Crista terminalis выглядит как темный мышечный гребень между придатком правого предсердия и SAN. Часто также можно увидеть, как артерия САН проходит через САН (Рисунок 2D).
