Система непрерывной инфузии лекарств на мышиной модели: хирургическая процедура имплантации микроосмотической насосной инфузионной системы в мозг мыши для непрерывной доставки лекарств

Аннотация

Источник: Ajoy, R., Chou, S. Y. Изучение сигнала гипоталамического инсулина к периферической непереносимости глюкозы с помощью системы непрерывного вливания лекарств в мозг мыши. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем сборку системы микроосмотического насоса для инфузии мозга с последующей ее хирургической имплантацией в череп мыши. Эта система обеспечивает непрерывную доставку потенциальных лекарств и облегчает изучение их влияния на мозг и мозговые ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка инфузионных систем с микроосмотическим насосом

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте насос, буфер для искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) и лекарство (раствор белка Met-CCL5/RANTES (10 нг/мл в aCSF)) в стерильных условиях с использованием буферов, отфильтрованных фильтрами 0,2 мкм, и проводите все процедуры под капюшоном для культуры в перчатках. Хирургические процедуры проводятся следующим образом:

1. Подготовьте микроосмотические насосы за день до операции: Наполните микроосмотический насос головного мозга искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) с помощью шприца объемом 1 мл и иглы с тупой головкой, которые входят в комплект. Погрузите микроосмотический насос в aCSF, поместите его на шейкер и осторожно встряхните в течение ночи.
   ВНИМАНИЕ: Насос должен быть заполнен кислотномозговой жидкостью, и следует избегать попадания пузырьков воздуха внутри насоса (Рисунок 1A).
2. Перед началом операции приготовьте раствор рекомбинантного белка Met-CCL5/RANTES (10 нг/мл, разведенный в аКСФ) для использования в эксперименте. Удалите aCSF из насоса и медленно заполните насос раствором препарата, пока излишки не вытекут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл раствора aCSF или Met-CCL5/RANTES достаточно для 5-8 насосов.
   ВНИМАНИЕ: Повторите процедуру, чтобы убедиться, что помпа полностью заполнена препаратом без пузырьков внутри.
3. Разрежьте трубки катетера до нужной длины и прикрепите их с помощью иглы для инфузионной терапии с тупым концом из набора для инфузии мозга. Наполните препаратом инфузионный набор и пробирки.
4. Наконец, соберите и прикрепите набор для инфузии мозга к микроосмотическому насосу.
   ВНИМАНИЕ: В трубке или насосе не должно образовываться пузырьков (Рисунок 1A).
5. Погрузите весь набор осмотического насоса и мозга в aCSF в стерилизованную пробирку объемом 50 мл, чтобы предотвратить высыхание насоса. Набор для осмотического сращения насоса и мозга теперь готов к использованию в хирургии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроосмотические насосные системы могут использоваться для длительной инфузии лекарственных препаратов. Это обеспечивает безопасный и удобный режим доставки лекарств в мозг мыши.

2. Внутримозговая хирургия желудочков – имплантация микроосмотического насоса

ВНИМАНИЕ: Стерилизуйте хирургическую среду с помощью 75% этанола и убедитесь, что люди, участвующие в исследовании, носят стерильные перчатки и чистый лабораторный халат. Хирургические инструменты/инструменты должны быть автоклавированы и высушены перед использованием, а затем стерилизованы 75% этанолом между операциями на мышах.

1. Взвесьте мышь и обезболите ее с помощью внутрибрюшинной инъекции (ВП) с кетамином/ксилазином (кетамин 50 мг/кг, ксилазин 10 мг/кг).
   ВНИМАНИЕ: Мышам с массой тела менее 24 г не рекомендуется проводить операцию по имплантации осмотической помпы.
2. Установите и закрепите головку мыши на стереотаксическом аппарате (рис. 1B).
3. С помощью хирургических ножниц и клещей разрежьте внешнюю кожу, покрывающую череп. Используйте йод для очистки периферического черепа.
4. Отделите внешний слой кожи от подкожной кожи с помощью пары клещей с тупой головкой в области шеи для имплантации осмотического насоса и мозгового комплекса (рис. 1C).
5. Отметьте точку инфузии относительно карты мозга (рисунок 1D) с помощью стереотаксического аппарата. В этом эксперименте игла должна быть имплантирована в область^3-го желудочка (Bregma: 0,0 мм латерально, 1,3 мм сзади, 5,7 мм вентрально).
6. Просверлите отверстие с помощью сверла для гвоздей вокруг области, отмеченной на черепе (Рисунок 1E).
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить мозговые оболочки и кровеносные сосуды мыши, тем самым избегая разрушения микрокровеносных сосудов в мозге.
7. Поместите микроосмотический набор для синтеза насоса и мозга, содержащий aCSF (в качестве контроля) или лекарственный препарат (раствор белка Met-CCL5/RANTES) под кожу за областью шеи и вставьте иглу для инфузии мозга в просверленное отверстие, чтобы ввести препарат в мозг мыши (рис. 1E). Игла проникнет в мозговые оболочки и попадет в желудочек. Закрепите иглу на месте на черепе с помощью поверхностного десенсибилизирующего геля (Рисунок 1F) и подождите 1-2 минуты, пока клей высохнет. Далее отрежьте выступающую часть сверху иглы (рисунок 1G-H).
8. Используйте тканевый клеевой клей для заживления операционной раны на голове. Нанесите 50 мкл клея поверх раны, стяните обе стороны кожи вместе и удерживайте в течение 30 секунд, чтобы кожа запечаталась (рис. 1I).
   ВНИМАНИЕ: Используйте 100% спиртовую салфетку для очистки раны после операции и 100 мкл пенициллина со стрептомицином для предотвращения инфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа мыши образует рубцовую ткань и заживает через несколько дней после введения хирургического клея. Основным преимуществом клея является отсутствие хирургических швов, которые могут вызвать раздражение или воспаление кожи.
9. Поместите мышь в чистую клетку на теплой тарелке (нагретой до 37 °C) и подождите, пока мышь оправится от обезболивающего эффекта.
   ВНИМАНИЕ: Крайне важно поддерживать температуру тела мыши, чтобы повысить шансы на выживание после операции.
10. После недельного периода восстановления мыши будут готовы к дальнейшим экспериментам, таким как пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) и тест на толерантность к инсулину (ITT).

Результаты

Рисунок 1. Осмотическая помпа и хирургическая процедура имплантации мыши. (А) Набор для инфузионной инфузии мозга и препарат насоса, пропущенный раствором лекарственного препарата. Красными стрелками обозначены катетерные трубки, заполненные жидкостью. (B) Закрепите и установите головку мыши на стереотаксический аппарат. (C) Отделить самый внешний слой кожи от подкож...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Vetbond Тканевый клей	3 МИН.	#1049SB	Клей, используемый для герметизации места поражения на голове мыши
LOCTITE 454 мгновенный клей	Корпорация Durect	#8670	Клей, используемый для фиксации иглы на черепе мыши
Микроосмотический насос Alzet	Корпорация Durect	#9922	0,11 μл в час, 28 дней
Система инфузии мозга	Корпорация Durect	#8851	1-3 мм, используется для перфузии препарата в мозг мышей
БЛОК УПРАВЛЕНИЯ MIO NE116 (дрель для ногтей)	Система Mio	#E235-015	Чтобы просверлить отверстие в черепе мыши
Формула aCSF	119 мМ NaCl 26,2 мМ NaHCO3 2,5 мМ KCl 1 мМ NaH2PO4 1,3 мМ MgCl2 10 мМ глюкоза		Фильтр простерилизовать с помощью фильтрующего аппарата 0,22 мкм и хранить при температуре 4°C. АКСФ стабилен в течение 3-4 недель