Методическая статья

Прижизненная визуализация: метод наблюдения на клеточном уровне за поджелудочной железой мыши через стабилизированное окно визуализации

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Парк, И. и Ким,. Стабилизированная продольная визуализация поджелудочной железы на клеточном уровне in vivo в мышиной модели с помощью окна прижизненной визуализации поджелудочной железы. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы описываем прижизненную визуализацию поджелудочной железы мыши через стабилизированное окно для долгосрочной визуализации клеточной динамики.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Прижизненная визуализация

  1. Включите прижизненный микроскоп, включая питание лазера.
  2. Включите грелку и установите гомеотермическую норму на 37 °C.
    заметка: В качестве альтернативы можно использовать пассивную грелку или лампу с частым контролем, если нет гомеотермической регуляции.
  3. Возьмем мышь с предварительно имплантированным окном поджелудочной железы. Провести внутримышечную анестезию смесью тилетамин/золазепам (30 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг).<бр/> заметка: Использование тилетамина/золазепама рекомендуется вместо кетамина из-за его побочного эффекта гипергликемии. С целью проведения экспериментов следует подбирать оптимальную анестезию.
  4. Введите сосудистый катетер для инъекции.
    1. Надавите на проксимальную сторону хвоста указательным и третьим пальцами в качестве альтернативы наложению жгута. При необходимости нагрейте хвост лампой.
    2. Простерилизуйте хвостовую вену спреем с 70% этанолом.
    3. Введите катетер 30 G в боковую хвостовую вену. Срыгивание крови будет визуализировано в пробирке PE10.
    4. Наложите шелковую ленту на катетер, чтобы стабилизировать его.
    5. Введите декстран FITC/TMR или другие флуоресцентные зонды (25 мкг анти-CD31, конъюгированного с Alexa 647), в зависимости от ситуации, в соответствии с комбинацией флуоресцентных зондов.
      заметка: Для введения флуоресцентных конъюгированных зондов антител за 2 ч до сеанса визуализации.
  5. Перенесите мышь с операционной платформы на сцену визуализации.
  6. Вставьте ректальный зонд для автоматического контроля температуры тела с помощью системы гомеотермических грелок.
  7. Вставьте окно для визуализации поджелудочной железы в держатель окна, подготовленный во время установки прижизненной микроскопии (рис. 1). Для инвертированного микроскопа держатель окна может не потребоваться.
  8. Выполнение прижизненной визуализации.
    1. Для визуализации поджелудочной железы начните с линзы объектива с малым увеличением (например, 4x) для сканирования всего вида поджелудочной железы в окне визуализации поджелудочной железы (рекомендуемое поле зрения: 2500 x 2500 μм).
    2. После определения области интереса переключитесь на объектив с большим увеличением (20x или 40x) для выполнения визуализации на клеточном уровне (рекомендуемое поле зрения: 500 x 500 μm или 250 x 250 μm). В этом эксперименте латеральное и осевое разрешение составило примерно 0,5 мкм и 3 мкм соответственно.
    3. Выполняйте z-стек или покадровую съемку для наблюдения за 3D-структурой или динамикой на клеточном уровне, такой как миграция клеток.
      заметка: Для визуализации флуоресцентных белков, экспрессирующих клетки трансгенных животных (MIP-GFP), 30 с прерывистого лазерного облучения с длиной волны 488 нм мощностью до 0,43 мВт было терпимым без заметного фотообесцвечивания или повреждения тканей. Для визуализации флуоресцентных белков, меченных Alexa 647, мощность лазера 640 нм до 0,17 мВт была приемлемой без заметного фотообесцвечивания или повреждения тканей. Длительное воздействие возбуждающего лазера с мощностью выше этого параметра может привести к фотообесцвечиванию или повреждению тканей в результате фототоксичности. Отрегулируйте достаточное усиление и мощность, чтобы правильно отобразить интересующую область. Детальная постановка параметров в прижизненной микроскопии должна быть индивидуализирована для каждой прижизненной микроскопии, подготовленной в институте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Фотография реализации окна прижизненной визуализации поджелудочной железы.Прижизненное окно для визуализации поджелудочной железы имплантируется в мышь на трансляционной стадии XYZ, а держатель камеры визуализации, прикрепленный к наклонному креплению, подключается к окну для визуализации поджелудочной железы. Copyright 2020 Корейская диабетическая ассоциация из Diabetes Metab J. 2020 44:1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 647 Сукцинимидиловые эфиры (NHS esters) Инвитроген А20006 Флуоресцентный зонд для конъюгата с антителом
Полиэтиленовая трубка BD Intramedic BD Biosciences 427401 Катетер PE10 для соединения с иглой
С57BL/6Н ОриентБио С57BL/6Н С57BL/6Н
Чехолы круглые Мариенфельд 0111520 Защитное стекло для окна для визуализации поджелудочной железы
FITC Dextran 2MDa Merck (бывшая Sigma Aldrich) ФД200С Для идентификации судна
ИМАРИС 8.1 Битовая плоскость ИМАРИС обработка изображений
Прижизненная микроскопия Технология IVIM IVM-C Прижизненная микроскопия
MIP-GFP Лаборатория Джексона 006864 В6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Хара/Дж
Окно визуализации поджелудочной железы Геумто Инжиниринг Индивидуальный заказ Окно визуализации поджелудочной железы - индивидуальный заказ
Физиолюкс Кент Сайентифик ПС-02 Гомеотермический регулятор температуры
TMR Dextran 65-85kDa Merck (бывшая Sigma Aldrich) Т1162 Для идентификации судна
Подставка для окна Геумто Инжиниринг Индивидуальный заказ Подставка для окон - под заказ
Золетил Вирбак Золетил 100 Обезболивающее средство
Ромпун Байер Ромпун Обезболивающее средство

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Intravital ImagingPancreatic Imaging WindowMouse PancreasCellular DynamicsFluorescent ProbesVascular CatheterIntravital MicroscopyGFP Beta CellsBlood Vessel StainingZ Stack Imaging

Похожие статьи