Модель антеградной перфузии: техника ex vivo для перфузии изолированного сердца мыши

Аннотация

Источник: Omatsu-Kanbe, M. et al., Метод антеградной перфузии для выделения кардиомиоцитов у мышей. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео описывает технику антеградной перфузии изолированного мышиного сердца, во время которой перфузат вводится через левый желудочек, и в конечном итоге, он перфузирует весь миокард. Этот метод может быть использован для выделения кардиомиоцитов из мышиных моделей и создания децеллюляризованных сердец для дальнейших применений.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Антеградная перфузия сердца мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая переводная пипетка, используемая для отсасывания сердца, должна быть мягкой и не должна резко сужаться к кончику. Выбирайте небольшой сосудистый зажим с зазубринами. Рекомендуемые инструменты перечислены в Таблице материалов.

1. Иссечение мышиного сердца и пережатие аорты<бр /> заметка: Взрослых мышей (в возрасте >8 недель) следует усыплять путем передозировки пентобарбитала натрия (>300 мг/кг, внутрибрюшинное [внутримышечное] введение) с гепарином (8000 ЕД/кг).
   1. Быстро иссеките мышиное сердце, посасывая.
      1. Быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце. Разрежьте пластиковую переводную пипетку, кончик которой примерно такого же размера, или немного меньше, чем обнаженное сердце (обычно на участке примерно в 1 см от отметки 0,5 мл по направлению к кончику, но это зависит от размера сердца).
      2. Всосите сердце в пипетку, поднимите пипетку, чтобы освободить достаточно места для введения ножниц, и иссеките сердце изогнутыми ножницами с тыльной стороны, не повреждая предсердия.
      3. Немедленно перенесите иссеченное сердце в стеклянный стакан объемом 30 мл с охлажденным льдом CIB-EGTA, чтобы остановить сокращение. Эта процедура обычно занимает <1 минуту.
   2. Чистка вокруг аорты
      1. Перенесите сердце в 35-миллиметровую культуральную чашку, наполненную охлажденным льдом CIB-EGTA, и удалите легкие и другие видимые ткани, а затем перенесите грубо очищенное сердце в подставку для сердца, наполненную охлажденным CIB-EGTA, и поместите его верхушкой вниз.
      2. Под стереоскопом удалите жир и соединительные ткани, чтобы очистить вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком длинная, включая брахиоцефальную артерию, левую общую сонную артерию или левую подключичную артерию, отрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией, чтобы укоротить ее, чтобы перейти к следующему этапу. Эта процедура обычно занимает около 4 минут
   3. Зажим аорты и размещение зажатого сердца на перфузионной пластине
      1. Введите инъекционную иглу и начните перфузию для отхождения крови
         1. Под микроскопом поместите сердце в подставку для сердца. Оператор должен повернуться лицом к передней поверхности сердца, подхватить конец аорты пинцетом, а аорту возле предсердий зажать небольшим сосудистым зажимом, при этом слегка надавливая на аорту.
         2. Поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх, а затем накройте его несколькими каплями CIB-EGTA, чтобы оно не высыхало. Эта процедура обычно занимает <20 с.
      2. Антеградная перфузия сердца<бр /> заметка: Во-первых, перфузируйте сердце с помощью CIB-EGTA для выделения крови и предотвращения свертывания.
         1. Введите инъекционную иглу и начните перфузию для отхождения крови
            1. Установите шприц объемом 20 мл, наполненный предварительно подогретым CIB-EGTA, подключенным к гибкой удлинительной трубке и маркированной игле для инъекций, на инфузионный насос. Запустите насос с медленной скоростью 0,5 мл/мин, чтобы осторожно заполнить иглу и трубку CIB-EGTA и убедиться, что воздух не попадает внутрь трубки.
            2. Поместите иглу для инъекции на перфузионную пластину более короткой стороной диагональной формы спереди. Сдвиньте иглу к верхушке сердца до тех пор, пока она не коснется его, а затем осторожно введите иглу возле верхушки левого желудочка в камеру желудочка, не перекручивая. Не отсоединяйте иглу от пластины во время введения.
            3. Следите за красной меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь, вытекающая из коронарной артерии, должна начать выделяться.
            4. Закрепите инъекционную иглу на пластине с помощью скотча, и увеличьте скорость насоса до 1 мл/мин. Эта процедура обычно занимает около 30 секунд. Если сердце успешно перфузировано, под микроскопом можно увидеть поток CIB-EGTA в капилляре прямо под эпикардом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Удлинительная трубка	Top, Япония	Х1-50	Соедините шприцем и инъекционной иглой для антеградной перфузии.
Коврик для обогревателя	Нацумэ Сэйсакусё, Япония	КН-475-3-40	Оборудование для подогрева перфузионной пластины.
Инфузионный насос	ТЕРУМО, Япония	ТЭ-311	Инфузионный шприцевой насос для антеградной перфузии.
Игла для инъекций (27 калибр)	ТЕРУМО, Япония	НН-2719С	Игла для введения в левый желудочек.
Инсулин (из бычьей поджелудочной железы)	Сигма-Олдрич, США	И5500	Растворить в 0,1 М HCl.
Пластиковый шприц (20 мл)	ТЕРУМО, Япония	СС-20ЧС	Использовать для инфузии CIB-EGTA.
Сосудистый зажим	Karl Hammacher GmbH, Германия	ОТ, ТБ и ООС 004-35	Небольшой прямой сосудистый зажим используется для пережатия аорты.
Все остальные реактивы	Накалаи Теске, Япония