Фиксация давления изолированного мышиного легочного клапана: процедура изоляции и химической фиксации мышиного легочного клапана в закрытой конформации

Аннотация

Источник: Liu, Y., et al. Хирургия и обработка образцов для корреляционной визуализации мышиного легочного клапана. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем процедуру выделения и химической фиксации легочного показателя мыши в закрытой конформации с помощью перфузионного давления.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Иссечение легочного клапана

1. Автоклав необходимых инструментов необходим для вскрытия мыши. К ним относятся тонкие ножницы, микрощипцы, микрососудистые зажимы, щипцы для наложения зажимов, держатели микроигл, пружинные ножницы и ретракторы.
2. Акклиматизируйте всех мышей минимум за 2 недели до операции. Извлеките мышей C57BL/6 в возрасте примерно 1 года из клеток и взвесьте, затем усыпьте их с помощью коктейля кетамин/ксилазин (3:1 кетамин:ксилазин, 0,01 мл на г).
3. Поместите мышь в лежачем положении на поднос и закрепите ее конечности скотчем. После закрепления выполните торакотомию.
   1. Обнажите сердце, удалив излишки жировой ткани и фасции.
   2. Удалите правое предсердие и перфузируйте через левый желудочек физиологическим раствором комнатной температуры (0,9% NaCl). Перфузия должна занимать примерно 20 мл в течение 30 с. Это приводит к обескровливанию мыши.
4. Удалите все сердце, отрезав верхнюю полую вену, нижнюю полую вену, легочную артерию и аорту. Особое внимание следует уделять легочной артерии. Разрежьте примерно на 2 мм выше вентрикуло-артериального соединения, так как это будет служить каналом для нагнетания давления.
5. Удалите левый и правый желудочки, чтобы подвергнуть камеры воздействию атмосферного давления. Следите за тем, чтобы структура легочного ствола не была затронута удалением желудочков.

2. Фиксация давления легочного клапана

1. Анастомозная герметизирующая трубка с легочной артерией, оставляющая расстояние примерно 1 мм между синотрубчатым соединением и концом трубки для приспособления больших движений створок и легочного ствола.
2. Поднимите резервуар до аналогичного физиологического давления и заполните его солевым раствором. Проверьте проточную систему, чтобы убедиться в отсутствии засоров или пузырьков воздуха.
3. Прикрепите запорный кран к анастомозированному легочному клапану и обеспечьте достаточный поток через трубку (т. е. отсутствие пузырьков воздуха) путем переключения выходного тракта. Как только поток станет достаточным, переключите отток на анастомозированный легочный клапан и обеспечьте давление в легочном стволе. Это определяется по растяжению легочного ствола.
4. Как только будет подтверждено давление в легочном стволе, постепенно вводите первичный фиксирующий раствор (1,25% глутаральдегида, 1,0% параформальдегида в 0,15 М какодилат) до тех пор, пока солевой раствор не будет очищен. Это делается путем удаления части, примерно 25% емкости резервуара, солевого раствора и замены его первичным фиксатором><. осторожность: Используемые фиксаторы (параформальдегид и глутаральдегид) являются высокотоксичными, и для обеспечения безопасности следует носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
5. Наложите на образец ткани марлю, смоченную в фиксаторах, чтобы предотвратить высыхание.
6. Перфузируйте фиксатор в течение 3 ч, наполняя резервуар по мере необходимости для поддержания постоянного давления. Во время фиксации легочный клапан нередко сжимается из-за химической фиксации. Если это так, постоянно пополняйте резервуар первичным фиксатором для поддержания физиологического давления.
7. Храните сердечный клапан в фиксирующем растворе при температуре 4 °C до использования. Образцы хранились до 1 недели без заметной разницы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
25% глутаральдегида (AQ)	ЭМС	16210	Первичный фиксирующий компонент
0,9% хлорида натрия для инъекций	Hospira Inc.	НДЦ 0409-4888-10
1 мл шприца	БД	309659
Шприц 10 мл	БД	309604
Игла 22G	БД	305156
3-х ходовой запорный кран	Смитс Медикал АСД, Инк	MX5311L
4% параформальдегида (АКВ)	ЭМС	157-4-100	Первичный фиксирующий компонент
C57BL/6 мышей	Лаборатории Джексона	664	Примерно 1 год
Зажим для наложения щипцов	ФСТ	00072-14 (Английский)
Щипцы Dumont #5	ФСТ	11251-20
Щипцы Dumont #5/45	ФСТ	11251-35
Тонкий щипец Dumont #7	ФСТ	11274-20
Тонкие ножницы	ФСТ	14028-10
Солевой раствор (стерильный 0,9% натрия хлорид)	Хоспира Инк	НДЦ 0409-0138-22
Хирургический микроскоп	Лейка	М80
Иглодержатель/щипцы Tish	Микрины	МИ1540
триммер	Валь	9854-500
Черный полиамидный монофиламентный шовный материал, 10-0	Корпорация AROSurgical instruments	TI38402
Черный полиамидный монофиламентный шовный материал, 6-0	Корпорация AROSurgical instruments	СН-1956
Инъекции кетамина гидрохлорида	Хоспира Инк	НДЦ 0409-2053
L-аспарагиновая кислота	Сигма-Олдрич	56-84-8	Компонент для окрашивания
Нитрат свинца	ЭМС	17900	Компонент для окрашивания
Тригидрат какодилата натрия	Сигма-Олдрич	Тел.: 6131-99-3	буфер
Песни из флизелина	Корпорация McKesson	94442000
Микроадзонный щипцы	ФСТ	11018-12
Фильтр Millex-GP, 0,22 мкм, PES 33 мм, нестерильный	EMD Millipore	SLGP033NS

шт. гг. г.