Сбор белых и коричневых жировых депо у депо мыши: хирургическая процедура по забору белой жировой ткани и бурой жировой ткани у детеныша мыши

Аннотация

Источник: Galmozzi, A. et al. Выделение и дифференциация первичных белых и коричневых преадипоцитов у новорожденных мышей. J. Vis. Эксп. (2021)

В этом видео мы демонстрируем хирургическую процедуру по выделению подкожной белой жировой ткани и межлопаточной коричневой жировой ткани у новорожденной мыши.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Сбор и переваривание жировых депо (день 1)

1. Подготовьте две пробирки объемом 1,5 мл для каждого щенка: одну для бурой жировой ткани (BAT) и одну для белой жировой ткани (WAT). Добавьте в каждую пробирку 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 200 мкл 2x изоляционного буфера (123 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,3 мМ CaCl₂, 5 мМ глюкозы, 100 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), пенициллин-стрептомицин и 4% бычьего сывороточного альбумина, не содержащего жирных кислот). Храните растворы стерильными и на льду.
2. Поместите детенышей в небольшие камеры (например, в одну лунку из 6-луночной пластины) и положите их на лед до тех пор, пока они не переохладятся. Следите за тем, чтобы между щенками и льдом не было прямого контакта. Уколите лапу наконечником, чтобы обеспечить потерю сознания, и усыпьте щенков путем обезглавливания острыми ножницами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: при работе с разными генотипами подготовьте дополнительную пробирку для забора биопсии хвоста (разрез 3 мм) для генотипирования. Если генотипирование выполняется немедленно, держите усыпленных щенков на льду до вскрытия для сбора жировых депо.
3. Рассчитайте и взвесьте количество коллагеназы, необходимое для переваривания всех депо. Добавьте 50 мкл 15 мг/мл коллагеназы I типа I в 2x изоляционном буфере в каждую пробирку. Не суспендируйте коллагеназу в изоляционном буфере до тех пор, пока не будут собраны все ткани.
4. Чтобы собрать подкожный WAT, разрежьте кожу вокруг живота щенка (избегайте разрыва брюшины) и аккуратно потяните кожу вниз ниже ног. Не снимая кожицу, тщательно соберите жировое депо, которое будет проявляться в виде прозрачной (Р1 или моложе) или белой (Р2 и старше), тонкой, удлиненной ткани, прикрепленной с внутренней стороны или сверху квадрицепсов (рисунок 1А, В). Промойте жировое депо в PBS и поместите его в одну из пробирок, содержащую 250 μL PBS + 200 μL 2x изоляционного буфера. Держитесь на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши P0 и P1 дают наилучший урожай. У щенков P0-1 подкожное депо WAT почти прозрачно. У мышей P2 и старше депо легче идентифицировать, потому что оно уже становится белым, что указывает на наличие полностью зрелых, насыщенных липидами белых адипоцитов.
5. Чтобы собрать межлопаточные БАТ, натяните кожу с лопаток над головой. Поднимите БАТ - темно-красную ткань между лопатками - и осторожно сделайте разрезы вокруг нее, чтобы отделить ее от тела (Рисунок 1А, Б). Проверьте на консистенцию и цвет; полоскать PBS; поместите его в другую пробирку, содержащую 250 μL PBS + 200 μL 2x изоляционного буфера; и держаться на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе БАТ у мышей P2 и старше осторожно удалите белую жировую ткань, окружающую БАТ. Он состоит из тонкого, мягкого, белого листа адипоцитов, расположенного между кожей и БАТ, который находится глубже между лопатками.

Результаты

Рисунок 1: Сбор и обработка жировых пакетов. (А) Схематическое изображение первичной изоляции адипоцитов белого (вверху) и коричневого (внизу) цветов. (B) Подкожные белые (вверху) и коричневые (внизу) жировые депо. У мышей P0 подкожный WAT почти незаметен, но становится различимым на ~2-й день после рождения. Напротив, BAT имеет отчетливый темный цвет даже при P0. У ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночные планшеты	Корнинг	353046
Не содержит жирных кислот (BSA)	Сигма-Олдрич	А8806
CaCl2	Сигма-Олдрич	С4901
глюкоза	Сигма-Олдрич	Г7021
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н3375
KCl	Сигма-Олдрич	П9333
NaCl	Сигма-Олдрич	С7653
Ручка/стрептококк	Gibco	15140122
Хирургические щипцы	РОБОЗ Хирургический Инструмент Co	РС-5158
Хирургические ножницы	РОБОЗ Хирургический Инструмент Co	РС-5880
DPBS, без кальция, без магния	Gibco	14190144