Выделение миоволокон: метод получения отдельных миоволокон из собранной мышцы-разгибателя большого пальца мыши (EDL)

Аннотация

Источник: Hüettner, S.S. et al. Анализ культуры одного миоволокна для оценки функциональности взрослых мышечных стволовых клеток ex vivo. J. vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует выделение одиночных миофибр из собранной мышиной мышцы Extensor Digitorum Longus (EDL). Выделенные миофибры могут быть культивированы для изучения активности мышечных стволовых клеток, связанной с миофиброй.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Изоляция мышц EDL и расщепление коллагеназы

1. Распылите на все оборудование 70% этанола, чтобы избежать загрязнения.
2. Принесите мышь в жертву в соответствии с национальными правилами экспериментов на животных.
3. Опрыскайте задние конечности мыши 70% этанолом. Используйте закаленные тонкие изогнутые ножницы (режущая кромка 24 мм) и тонкие щипцы (Dumont 7, изогнутые или прямые), чтобы удалить кожу и обнажить нижележащие мышцы. Избегайте любого контакта подлежащих мышц с мехом (увеличивает риск загрязнения).
4. Удалите окружающую фасцию с помощью тонких изогнутых щипцов, не повреждая подлежащие мышцы (рисунок 1A). Закройте щипцы, чтобы избежать сгибания.
5. Используйте изогнутые щипцы для обнажения дистальных сухожилий передней большеберцовой кости и мышцы EDL. Чтобы удалить ТА, захватите дистальное сухожилие ТА щипцами и разрежьте тонкими пружинными ножницами Vannas (режущая кромка 5 мм, диаметр кончика 0,35 мм). Удерживая TA в сухожилии, потяните его к колену и разрежьте мышцу ближе к колену (Рисунок 1B), теперь мышца EDL обнажена.
   заметка: Убедитесь, что на этом этапе захватывается только сухожилие ТА, в противном случае может быть повреждено основное сухожилие ЖВЛ. При отрезании мышцы ТА убедитесь, что сухожилия в колене могут быть легко видны впоследствии.
6. Подтяните дистальное сухожилие EDL с помощью тонких изогнутых щипцов и разрежьте тонкими пружинными ножницами Vannas (Рисунок 1C). Обнажите проксимальное сухожилие EDL, осторожно потянув EDL к колену. Разрежьте проксимальное сухожилие тонкими пружинными ножницами Vannas. Перенесите мышцу EDL в предварительно нагретый до 37 °C 2,5 мл раствора для расщепления коллагеназы в реакционной пробирке объемом 15 мл. Раствор коллагеназы готовится следующим образом:
   1. Приготовьте раствор для расщепления коллагеназы путем растворения 0,2% (w/v) коллагеназы типа 1 (из Clostridium histolyticum) в DMEM (модифицированная среда Dulbecco Eagle's с 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрия), отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. (Рисунок 1D).
      заметка: Сделайте небольшой разрез на внешней части соединительной ткани колена, чтобы полностью обнажить проксимальный отдел сухожилия EDL. Следите за тем, чтобы захватывать только сухожилия и не растягивать EDL слишком сильно.
7. Повторите шаги с 1.3. по 1.6 со вторым ЖНВЛП. Добавьте обе мышцы EDL в одну и ту же реакционную пробирку объемом 15 мл, заполненную раствором для расщепления коллагеназы объемом 2,5 мл.
8. Инкубируйте мышцы EDL в реакционной трубке при температуре 37°C на циркуляционной водяной бане.
   заметка: Время инкубации зависит от нескольких факторов, таких как активность коллагеназы, возраст мыши и количество фиброзной ткани. Типичное время инкубации мышц EDL взрослых мышей (в возрасте 2-6 месяцев) составляет 1-1,5 ч, а для старых мышей (в возрасте 18 месяцев) - 1,5-2 ч.
9. Чтобы избежать чрезмерного переваривания мышц, проверяйте мышцы во время переваривания. Остановите пищеварение, когда мышцы расслабляются и видны отдельные миоволокна (рисунок 1E). Осторожно перенесите мышцы с помощью пипетки большого диаметра в первую лунку предварительно разогретого 12-луночного планшета, содержащего изолирующую среду миоволокна (рисунок 1G), который готовят следующим образом:
   1. Дополните DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle's с 4,5 г/л глюкозы и пируватом натрия) с 20% FBS (фетальная бычья сыворотка), профильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Добавьте среду в предварительно покрытые изоляционные планшеты (12-луночный планшет, 2-4 мл изоляционной среды на лунку) примерно за 30 минут до изоляции и уравновесьте в увлажненном инкубаторе при температуре 37°C с 5%_CO2.

2. Диссоциация миофибры

1. Для следующих этапов используйте стереобинокулярный микроскоп, предпочтительно оснащенный нагревательной пластиной (37 °C). Используйте пипетку с большим отверстием, чтобы промыть мышцы теплой изолирующей средой до тех пор, пока не высвободятся отдельные миоволокна. Диссоциируйте мышцы с помощью пипетки большого диаметра до тех пор, пока нужное количество миоволокон не будет свободно плавать в растворе><. заметка: Избегайте чрезмерного растирания, чтобы снизить риск повреждения миоволокон. Настоятельно рекомендуется использовать нагревательную пластину для диссоциации миоволокна, так как в процессе изоляции температура падает, что приведет к гибели миоволокна.

Результаты

Рисунок 1. Мышиная EDL-диссекция и выделение одного миоволокна.(A) Кожа задней конечности мыши удаляется, а мышца, окружающая фасцию, оттягивается, чтобы обнажить мышцу TA (переднюю большеберцовую кость). (B) Мышца TA удаляется, чтобы обнажить мышцу EDL (extensor digitorum longus), отмеченную белой стрелкой. (C) Мыш...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллагеназа 1 типа	сигма	С0130
DMEM (модифицированная среда Дульбекко с глюкозой 4,5 г/л и пируватом натрия)	GibCo	41966029	Среда для культивирования клеток
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270-106	Фетальная бычья сыворотка