$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Иглы для стерильного стекла
- Включите игольчатый съемник пипетки.
- Отрегулируйте ручку нагревателя до тех пор, пока на дисплее не появится 12,6.
- Откройте дверцу и вручную подайте капиллярную трубку объемом 5 мкл через верхний зажим и нить нагревателя, пока половина трубки не опустится ниже нити накала (рис. 1A).
- Убедитесь, что капиллярная трубка находится в V-образной канавке в верхнем зажиме. Затяните верхний зажим.
- Когда нижний зажим открыт, вручную отрегулируйте вертикальное скольжение вверх, пока нижний зажим не достигнет своего верхнего предела. Убедитесь, что трубка находится в V-образном пазу в нижнем зажиме. Затяните нижний зажим.
- Закройте дверцу и убедитесь, что горит индикатор «Готов». Нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить нагреватель и последовательность вытягивания (Рисунок 1B).
- Убедитесь, что нагреватель выключается автоматически после того, как тепло и сила тяжести раздвигают капиллярную трубку (Рисунок 1C), и предметное стекло движется вниз.
- Откройте дверь. Удерживая верхнюю часть капиллярной трубки, ослабьте верхний зажим. Извлеките верхнюю капиллярную трубку и отложите ее в сторону.
- Удерживайте капиллярную трубку в нижней горке и ослабьте нижний зажим. Извлеките нижнюю капиллярную трубку и отложите ее в сторону.
- Используйте станок для снятия фаски с микроэлектродами и шлифовальной пластиной из оксида алюминия 0,05 мкм для снятия фаски с вытянутой капиллярной трубки для создания инъекционных игл.
- Нанесите пипеткой достаточное количество воды на шлифовальную пластину, чтобы покрыть поверхность (Рисунок 1D).
- Включите фаску так, чтобы она начала вращаться со скоростью 60 оборотов в минуту. Поместите вытянутую капиллярную трубку в зажим для пипетки в V-образном пазу. Затяните зажим и отрегулируйте угол наклона зажима для пипетки на 30°.
- Отрегулируйте кончик заостренного края капиллярной трубки примерно на расстоянии двух третей от центра вращения шлифовальной пластины.
- Опустите зажатую капиллярную трубку, отрегулировав ручку грубого управления в верхней части манипулятора. Продолжайте опускать капиллярную трубку до тех пор, пока кончик капиллярной трубки не опустится ниже поверхности воды и не соприкоснется с абразивной поверхностью шлифовальной пластины.
- Следите за ходом снятия фаски с помощью микроскопа, установленного на беваллере. Через 5 минут отрегулируйте тонкий контроль, чтобы поднять стеклянную иглу с шлифовальной пластины.
- Снимите стеклянную иглу и поместите ее под 10-кратное увеличение, чтобы проверить кончик капиллярной трубки (рис. 1E, F).
- Чтобы убедиться в отсутствии засоров, вставьте стеклянную иглу в держатель для пипетки на шприце и нагнетайте воздух в пробирку объемом 1 мл с 99% этанолом. Если на кончике иглы образуются пузырьки воздуха, игла не имеет закупорок и может использоваться для микроинъекций. Этот процесс также обеспечивает стерильность стеклянных игл.
- Одна капиллярная трубка может вмещать до 5 мкл жидкости. Разметьте капиллярную трубку на 10 секций, чтобы рассчитать расстояния на игле для разметки для объемов 0,5 мкл. Отметьте шкалу с таким расстоянием, которое вмещает 0,5 мкл для будущего приготовления. Для иглы объемом 5 мкл расстояние 0,7 мм составляет 0,5 мкл (рис. 1G).
2. Интравитреальная инъекция мыши
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в условиях уровня биобезопасности 2.
- Подготовьте место проведения процедуры, положив на операционный стол медицинские пеленки.
- Включите микроинъектор и откройте газовый клапан на баллоне сжатого воздуха, прикрепленном к микроинжектору. Отрегулируйте регулятор бака до тех пор, пока подача газа не составит примерно 60 фунтов на квадратный дюйм.
- На микроинъекторе нажимайте Mode (Режим), пока на экране не появится надпись Balance. Нажмите Balance и поместите компьютерную мышь на операционный стол. Подсоедините держатель пипетки из нержавеющей стали к трубке, прикрепленной к функции «Заполнение/Выход» инжектора. Эта трубка всегда подсоединена к инжектору.
- Вставьте капиллярную иглу на другой конец держателя пипетки, плотно закрутив соединитель держателя пипетки вокруг иглы.
- Включите офтальмологический микроскоп и включите его свет до интенсивности 50%. Наведите микроскоп на место проведения процедуры на операционном столе и установите микроскоп в нужное положение.
- Перед началом процедуры убедитесь, что мышь адекватно обезболивается, проверив рефлекс отмены педали. Обязательно следуйте протоколу анестезии, утвержденному IACUC.
- Поместите мышь под наркозом на медицинские пеленки носом вправо и опирайтесь на левый бок.
- Посмотрите на правый глаз мыши через офтальмологический микроскоп и откройте веки, открыв щипцы обратного действия с обеих сторон глаза, чтобы обнажить место инъекции (рис. 2C).
- Заполните капиллярную иглу бактериальным раствором Bacillus cereus (ATCC 14579) (разведение 200 КОЕ/мкл), щелкнув левой кнопкой мыши по коврику для мыши, подключенному к микроинъектору (рис. 2D).
- Зафиксируйте голову животного левой рукой и поместите кончик иглы в лимб глаза. Когда игла находится в положении скоса и под углом 45°, проколите глаз мыши, но убедитесь, что при введении введен только острый кончик иглы (~0,5 мм).
- После того, как кончик иглы будет вставлен, переместите левую руку с головки мыши на коврик для мыши и щелкните правой кнопкой мыши по коврику для мыши, чтобы ввести 0,5 мкл разведения B. cereus, приготовленного в бульоне Brain Heart Infusion (BHI). Чтобы предотвратить утечку, перед извлечением оставьте кончик иглы внутри мышиного ушка на 2–3 секунды (рисунок 2E).
- Отпустите щипцы и поместите мышь в клетку, которая сидит на грелке. Наблюдайте за этими мышами до тех пор, пока они не оправятся от анестезии (рисунок 2F).
- Как только мыши оправятся от анестезии, верните клетку на надлежащую стойку. Если мыши будут подвергнуты анализу функции сетчатки с помощью электроретинографии, клетки должны быть возвращены в темную комнату для надлежащей адаптации к темноте.
