$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка трубки для уборки
урожая
- Поместите стерильные стеклянные шарики диаметром 1 мм в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл.
- Простерилизуйте эти пробирки в автоклаве в сухом режиме. Перед использованием дайте трубкам остыть до комнатной температуры.
- Добавьте 10 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте в тюбик 1 таблетку коктейля ингибитора протеазы. Перемешайте путем вортексинга.
- Пипетка 400 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего ингибитор протеазы, в каждую автоклавную пробирку для забора. Наклейте на пробирки маркировку и выложите на лед. (Рисунок 1А).
2. Сбор урожая глаз
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в условиях уровня биобезопасности 2.
- Усыпьте мышь путем ингаляцииCO2. Используйте вторичный метод для подтверждения эвтаназии.
- Крепко держите голову усыпленной мыши и откройте щипцы с тонким наконечником по обе стороны от инфицированного глаза. Надавите вниз по направлению к голове, чтобы проптозать глаз. Как только щипцы окажутся за глазным яблоком, сожмите щипцы вместе. Оттяните щипцы от головы, чтобы отделить глазное яблоко (рисунок 1B).
- Сразу же поместите глазное яблоко в пробирку с этикеткой. Поместите трубки на лед не более чем на 60 минут (рисунок 1C).
3. Внутриглазное количество бактерий
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в условиях уровня биобезопасности 2.
- Убедитесь, что все пробирки плотно закрыты и сбалансированы во время нахождения в тканевом гомогенизаторе (Рисунок 2A). Включите гомогенизатор тканей на 1 минуту для гомогенизации образцов. Подождите 30 с, затем включите еще на минуту. Положите трубки на лед (рис. 2B,C).
- Последовательно разбавляйте каждый образец в 10 раз, последовательно перенося 20 мкл гомогената в 180 мкл стерильного 1x PBS. Разбавляйте до достижения коэффициента 10-7 (Рисунок 2D).
- Пометьте каждый ряд теплой квадратной пластины BHI соответствующими коэффициентами разбавления. Перенесите 10 мкл каждого разведения подряд на верхнюю пластину BHI, наклоненную примерно на 45°. Дайте образцу течь, пока он почти не достигнет дна пластины, затем положите пластину плашмя (Рисунок 2E).
- Когда образец впитается в агар BHI, перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C. Колонии должны начать быть видны через 8 ч после помещения в инкубатор.
- Извлеките планшет из инкубатора до того, как рост колоний B. cereus помешает идентификации отдельных колоний (рисунок 2F).
- Чтобы получить точное представление о концентрации в образце, посчитайте ряд, в котором насчитывается от 10 до 100 колоний. Например, ряд с фракцией разбавления 10-4, имеющий 45 колоний, будет иметь концентрацию 4,5 х 105 КОЕ/мл.
- Чтобы рассчитать общее количество бактерий на глаз, умножьте концентрацию на 0,4, что соответствует миллилилитровому объему 1x PBS, используемому для гомогенизации глаза. Например, концентрация 4,5 x 105 КОЕ/мл будет означать 1,8 x 105 КОЕ B. cereus на глаз.
