Количественный анализ бактериальной инфекции: метод количественной оценки внутриглазной бактериальной нагрузки на мышиной модели бактериального эндофтальмита

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка трубки для уборки

1. Поместите стерильные стеклянные шарики диаметром 1 мм в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл.
2. Простерилизуйте эти пробирки в автоклаве в сухом режиме. Перед использованием дайте трубкам остыть до комнатной температуры.
3. Добавьте 10 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. Добавьте в тюбик 1 таблетку коктейля ингибитора протеазы. Перемешайте путем вортексинга.
5. Пипетка 400 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего ингибитор протеазы, в каждую автоклавную пробирку для забора. Наклейте на пробирки маркировку и выложите на лед. (Рисунок 1А).

2. Сбор урожая глаз

1. Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в условиях уровня биобезопасности 2.
2. Усыпьте мышь путем ингаляции_CO2. Используйте вторичный метод для подтверждения эвтаназии.
3. Крепко держите голову усыпленной мыши и откройте щипцы с тонким наконечником по обе стороны от инфицированного глаза. Надавите вниз по направлению к голове, чтобы проптозать глаз. Как только щипцы окажутся за глазным яблоком, сожмите щипцы вместе. Оттяните щипцы от головы, чтобы отделить глазное яблоко (рисунок 1B).
4. Сразу же поместите глазное яблоко в пробирку с этикеткой. Поместите трубки на лед не более чем на 60 минут (рисунок 1C).

3. Внутриглазное количество бактерий

1. Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в условиях уровня биобезопасности 2.
2. Убедитесь, что все пробирки плотно закрыты и сбалансированы во время нахождения в тканевом гомогенизаторе (Рисунок 2A). Включите гомогенизатор тканей на 1 минуту для гомогенизации образцов. Подождите 30 с, затем включите еще на минуту. Положите трубки на лед (рис. 2B,C).
3. Последовательно разбавляйте каждый образец в 10 раз, последовательно перенося 20 мкл гомогената в 180 мкл стерильного 1x PBS. Разбавляйте до достижения коэффициента ^10-7 (Рисунок 2D).
4. Пометьте каждый ряд теплой квадратной пластины BHI соответствующими коэффициентами разбавления. Перенесите 10 мкл каждого разведения подряд на верхнюю пластину BHI, наклоненную примерно на 45°. Дайте образцу течь, пока он почти не достигнет дна пластины, затем положите пластину плашмя (Рисунок 2E).
5. Когда образец впитается в агар BHI, перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C. Колонии должны начать быть видны через 8 ч после помещения в инкубатор.
6. Извлеките планшет из инкубатора до того, как рост колоний B. cereus помешает идентификации отдельных колоний (рисунок 2F).
7. Чтобы получить точное представление о концентрации в образце, посчитайте ряд, в котором насчитывается от 10 до 100 колоний. Например, ряд с фракцией разбавления ^10-4, имеющий 45 колоний, будет иметь концентрацию 4,5 х 10⁵ КОЕ/мл.
8. Чтобы рассчитать общее количество бактерий на глаз, умножьте концентрацию на 0,4, что соответствует миллилилитровому объему 1x PBS, используемому для гомогенизации глаза. Например, концентрация 4,5 x 10⁵ КОЕ/мл будет означать 1,8 x 10⁵ КОЕ B. cereus на глаз.

Рисунок 1: Забор инфицированного глаза мыши. После заражения, по прошествии желаемого периода времени, соберите инфицированные глаза мыши с помощью стерильного пинцета. (А) ПБС, содержащие стерильные стеклянные шарики. (B) Забор инфицированного глаза. (C) Трубка для сбора урожая, содержащая мышиный глаз.

Рисунок 2: Обработка собранного глаза на внутриглазное количество бактерий. (A) Заборная трубка с инфицированным глазом плотно прижата к тканевому гомогенизатору. (B) Инфицированные глаза гомогенизировали дважды по 1 минуте каждый. Отслеживайте разведение (D) гомогенатов глаза (C) и последующее нанесение покрытия (E) для количественного определения бактерий. (E) Репрезентативная особь колонии Bacillus cereus после разведения следов.