Перфузия легких ex vivo: методика исследования легких на модели кролика

Аннотация

Источник: Пачеко-Балтазар, А., и др., Изолированная система перфузии легких в модели кролика. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео показана техника ex vivo для изолированной перфузии легких. Это инструмент для исследования легких, который поможет в изучении различных физиологических и патологических механизмов, связанных с процедурами трансплантации легких.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Канюляция:

1. Поместите легкие только что изолированного кролика вместе с сердцем на стерильную марлю на чашку Петри.
2. Для предотвращения ателектаза проводите вентиляцию легких с помощью вентиляции с положительным давлением и положительным давлением в конце выдоха (PEEP), установленным на уровне 2 смЧ₂О.
3. Удаляют желудочки, отрезав их от сердца на уровне атриовентрикулярной борозды.
4. После вскрытия двух желудочков ввести канюлю легочной артерии диаметром 4,6 мм для кролика с корзиной через легочную артерию и ввести канюлю левого предсердия диаметром 5,9 мм для кролика с корзиной через митральный клапан в левое предсердие.
5. Используйте шелковый шов 4-0 в легочной артерии и левом предсердии для фиксации канюль. Включите окружающие ткани в лигатуры легочной артерии и левого предсердия, чтобы избежать растяжения этих структур.
6. Введите 250 мл изотонического раствора физиологического раствора через артериальные канюли, чтобы смыть оставшуюся кровь из сосудистого русла.

2. Техника перфузии:

1. настройка:
   1. Осторожно поместите изолированные легкие в легочную камеру.
   2. Прикрепите трахею к преобразователю на крышке камеры.
   3. Подсоедините канюлированные сосуды к системе перфузии.
   4. Закройте патронник и зафиксируйте его поворотным замком.
      заметка: Рециркуляционный контур перфузии состоит из открытого венозного резервуара, перистальтического насоса, теплообменника и пузырьковой ловушки.
   5. На этом этапе прикрепите крышку камеры и переключите запорный кран для переключения с вентиляции с положительным на отрицательным давлением. Для проверки отрицательного давления вентиляции легких и герметичного закрытия камеры необходимо проверить дыхательную экскурсию легких и давление в камере по манометру.
   6. Перфузируйте легкие 200 мл искусственного бескровного перфузата (бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий 2,5% бычьего альбумина).
   7. Начните подачу перфузата с 3 мл/мин/кг, затем медленно увеличивайте поток в течение 5 минут до 5 мл/мин/кг. Достигните расхода 8 мл/мин/кг в течение следующих 5 минут, а затем через еще 5 минут достигните максимального потока 10 мл/мин/кг. Следите за тем, чтобы воздух не попадал в контур.
      заметка: Поддерживайте pH и температуру перфузата в физиологических пределах (pH 7,4-7,5; температура 37 °C-38 °C). Чтобы отрегулировать pH, добавьте NaHCO₃ (1N) или увеличьте поток углекислого газа. В качестве альтернативы используйте HCl (0,1N) для подкисления.
2. Параметры:
   1. Проверьте, заданы ли заданные параметры перфузии и вентиляции в соответствии с требованиями.
   2. Вентиляцию легких увлажненным воздухом с частотой 30 уд/мин, дыхательным объемом 10 мл/кг и давлением в конце выдоха (ПЭ) 2 смН₂О.<бр/> заметка: Легочное артериальное давление (0-20 мм рт.ст.) соответствует высоте уровня жидкости в оксигенаторе или резервуаре в сантиметрах над легочным стволом, в то время как легочное венозное давление соответствует высоте камеры уравновешивания давления над левым предсердием. Оба значения могут быть изменены. Обратите внимание, что давление в левом предсердии также составляет 0-20 мм рт.ст.
3. Достижение условий зоны 3:
   1. Используйте два катетера, подключенных к боковым портам канюль, закрепленных в легочной артерии, левом предсердии, и датчики давления для измерения артериального (Pa) и венозного (Pv) давления.
   2. Установите базовое давление на уровне ворот легких (нулевая привязка).
   3. Проводите эксперименты в условиях вентиляции зоны 3. Для этого нужно подождать 10-15 мин для получения равновесия, характеризующегося изогравиметрическим состоянием.
   4. Убедитесь, что венозное давление выше альвеолярного давления (Palv), а артериальное давление остается выше, чем оба (Pa > Pv > Palv) для возникновения условий зоны 3.
   5. Убедитесь, что вес легких остается постоянным, а артериальное давление и давление в левом предсердии стабильно для достижения условий зоны 3 для открытия максимального числа легочных сосудов и поддержания содержимого микрососудистого русла во время эксперимента.
      заметка: Измерение Kfc в качестве индикатора отека легких не имеет различий между ручной и автоматической перфузионной системой.
4. Электронное управление и обработка сигналов: Убедитесь, что дыхательный поток, изменения веса, микрососудистое давление, дыхательный объем, сосудистое сопротивление и т.д. регистрируются на нескольких центральных электронных блоках, которые интегрируют сигналы, поступающие от датчиков, и отображают их в системе оценки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-ступенчатая трубка Tygon E-Lab, внутренний диаметр 3,17 мм, 12/упаковка, черный/белый	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-1864
Адаптер для вентиляции под положительным давлением на ИПЛ-4	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4312 (Английский
Адаптер для вентиляции под положительным давлением на ИПЛ-4	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4312 (Английский
Альтернативная подача газа без давления для IPL-4: Для подачи в трахею газовой смеси, отличной от воздуха в помещении, при отрицательной вентиляции	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4309 (Английский
Базовый блок для кролика и плода свиньи изолирован от перфузии легких	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4138
Бычья сыворотка A2:D41альбумин лиофилизированный порошок	сигма	No 3912	500 г
Хлорид кальция, CaCl2·2H2O.	Джей Ти Бейкер	10035-04-8
Криогенные флаконы	Корнинг	430659	2 мл
D-глюкоза, C6H12O6.	сигма	Г5767
Дифференциальный преобразователь низкого давления DLP2.5, диапазон +- 2,5 см H2O, разъем HSE	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-3882 (Английский
Преобразователь дифференциального давления MPX, диапазон +- 100 см H2O, разъем HSE	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0064 (Английский
Трубки Eppendorf
Абсолютный сорт этанола ВЭЖХ	Каледонская
Трубки Falcon			14 мл
Гарвардский перистальтический насос P-230 (в комплекте с блоком управления и моторным приводом P-230)	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	70-7001
Линейный пневмотахометр с подогревом, диапазон расхода от 0 до 10 л/мин	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	59-9349 (Английский
Контроллер нагревателя для одного пневмотахометра 230 В переменного тока, 50 Гц	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	Телефонный номер 59-9703
Гепарин	Пиза		5000 УИ
Колонна ВЭЖХ (C18 100A 5U)	Аллтек	98121213	150 мм x 4,6 мм
Гидрофильный шприцевой фильтр	Миллэкс	SLLGR04NL	4 мм
IPL-4 Стержневая система для изолированного легкого кролика и плода свиньи, 230	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4296 (Английский
IPL-4 Core System для изолированного легкого кролика и плода свиньи, 230 В	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4296 (Английский
Стеклянный резервуар с рубашкой для буферного раствора, с фриттой и трубкой, 6,0 л	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0322 (Английский
Термостатический термостат Lauda, тип E-103, 230 В/50 Гц, объем ванны 3 л, диапазон температур от 20 до 150°C	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0125 (Английский
Канюля левого атриума для кролика с корзиной, внешний диаметр 5,9 мм	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4162
Датчик артериального давления низкого диапазона P75 для модуля PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0020 (Английский
Гептагидрат сульфата магния, MgSO4·7H2O	Джей Ти Бейкер	10034-99-8 (Английский
Микроцентрифужная трубка	Корнинг	430909
Опция управления вентиляцией с отрицательным давлением с регулятором давления для IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4298 (Английский
Новозеландские кролики
ПИЗАБЕНТАЛ (Пентобарбитал натрия)	Пиза	В-7833-215
Чехол PLUGSYS, тип 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0045 (Английский
Модуль счетчика времени PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-1750
Модуль усилителя преобразователя PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-0065 (Английский
Модуль усилителя преобразователя PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Модуль управления вентиляцией с регулятором давления	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-1755
Хлорид калия, KCl.	Джей Ти Бейкер	3040-01
Калия дигидрофосфат, KH2PO4	Джей Ти Бейкер	7778-77-0 (Английский
Канюля легочной артерии для кролика с корзиной, наружный диаметр 4,6 мм	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4161
Сервоконтроллер для перфузии (SCP	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-2806
Трубка для микроцентрифуги с защелкивающейся крышкой	Костар	No 3620	1,7 мл
Бикарбонат натрия, NaHCO3	сигма	С6014
Хлорид натрия, NaCl.	сигма	С9888
Перчатки хирургические No7 1/2
Перчатки хирургические No8
Трубки Taygon	Мастерфлекс
Канюля трахея для кролика, наружный диаметр 5,0 мм	Hugo Sachs Elektronik (НИУ ВШЭ)	73-4163

гг. ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) гг. ) гг. гг. )