Подготовка сознательной модели кролика к одновременной видео-ЭЭГ-ЭКГ-оксиметрии-капнографии для экспериментальных вмешательств: процедура имплантации электродов ЭЭЭ-ЭКГ и прикрепления дыхательных зондов в модели кролика

Аннотация

Источник: Bosinski, C. et al., Мультисистемный мониторинг для идентификации судорог, аритмий и апноэ у кроликов, находящихся в сознании. J. vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует процедуру имплантации электродов ЭЭГ-ЭКГ и подключения дыхательных зондов в модели кролика для получения и анализа записей его биосигналов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Имплантация электродов ЭЭГ-ЭКГ и прикрепление дыхательных мониторов

1. Снимите одного кролика с переноски и посадите на колени сидящего следователя.
2. Держите кролика вертикально и держите его близко к телу следователя.
3. Опустите кролика в положение лежа на спине, так, чтобы голова кролика находилась на коленях исследователя, а голова кролика была ниже остального тела.
   заметка: Этот маневр расслабляет животное и сводит к минимуму вероятность того, что оно попытается двигаться или убежать во время установки электродов.
4. Теперь, когда кролик закреплен в лежачем положении, попросите второго исследователя расстелить мех до тех пор, пока кожа не будет идентифицирована и изолирована от подлежащих тканей.
5. Вставьте согнутые под углом 35° электроды субдермально в каждую подмышечную впадину (рис. 1A).
   заметка: Электроды следует протолкнуть насквозь, чтобы они были надежно зацеплены за кожу, но не проникали в более глубокие структуры. Если электрод входит в кожу и затем выходит из нее (сквозной), снижается вероятность смещения проводов при помещении кролика в ограничитель или при его перемещении во время эксперимента (рис. 1B). Перед установкой все электроды стерилизуются 70% этанолом.
6. Место проводит на грудной клетке сзади справа и слева на передних конечностях и на животе спереди на левую заднюю конечность. Поместите заземляющий штифт-электрод спереди правой задней конечности на брюшную полость (рисунок 2A).
7. После того, как все провода ЭКГ будут правильно размещены, верните кролика в положение лежа, при этом провода будут проходить вверх по одной стороне живота кролика, и переложите кролика в удерживающее устройство соответствующего размера (например, 6 x 18 x 6 дюймов). Примотайте провода скотчем сбоку от ограничителя, чтобы они не застряли под кроликом во время эксперимента (рисунок 2В).
8. Закрепите кролика в удерживателе, опустив ограничитель вокруг шеи и зафиксировав его на месте. Кроме того, поднимите задние конечности вверх под животным и закрепите заднюю фиксацию.
   заметка: Нужно иметь возможность поместить 1-2 пальца в пространство под шеей, чтобы убедиться, что оно не слишком тугое. В частности, во время экспериментов, где может наблюдаться двигательное движение, важно затянуть удерживающее устройство, чтобы свести к минимуму движение, возможные травмы позвоночника, вывих конечностей и возможность выкинуть задний ограничитель (Рисунок 2B). Кролики содержались в удерживающем устройстве в течение ~5 часов без каких-либо проблем, связанных с повышенной подвижностью или признаками обезвоживания.
   1. Для маленьких кроликов (например, младше 2 месяцев) подложите под животное резиновую усилительную накладку, чтобы поднять кролика вверх, что не позволит кролику упираться шеей в нижнюю часть подголовника (рис. 2C).
      заметка: Внезапное снижение частоты дыхания и сердечного ритма может быть вторичным по отношению к импинджменту шеи. Если это произойдет, ослабьте фиксатор шеи и поднимите голову кролика, чтобы уменьшить сдавливание шеи.
   2. Если заднее крепление не проходит по спине/позвоночнику кролика, установите распорку из ПВХ, чтобы предотвратить любое движение, которое может привести к травмам позвоночника><. заметка: Например, труба из ПВХ длиной ~14 см и внутренним диаметром 4 дюйма, при этом нижние 25-33% могут быть размещены над кроликом с помощью пенопласта для обеспечения соответствующей фиксации (Рисунок 2C).
9. Теперь, когда кролик надежно помещен в ограничитель, вставьте в кожу головы подкожные прямые штифт-электроды диаметром 7-13 мм (рисунок 1А). Используя угол входа под углом 45°, проведите провода между ушами и свободно привяжите провода к ограничителю за головой, чтобы сохранить положение провода. Разместите 5 отведений ЭЭГ в следующих положениях: правое переднее, левое переднее, правое затылочное, левое затылочное и центральное опорное (Cz) отведение в точке между другими 4 отведениями (Рисунок 2D).
   заметка: Электроды правильно размещаются, когда они расположены в подкожной клетчатке напротив черепа. Такое расположение сводит к минимуму артефакты из носа, ушей и других окружающих мышц. Некоторые артефакты от ритмичных движений носа неизбежны. Передние отведения ЭЭГ должны быть расположены медиально по отношению к глазам кролика и направлены спереди. Затылочные отведения должны располагаться спереди от ушей и должны быть направлены в медиальном направлении. Cz размещается в центре макушки головы в точке, которая находится между всеми 4 электродами (на полпути между Lambda и Bregma, вдоль линии шва). Штифт Cz электрода направлен вперед.
   1. Проведите провода ЭЭГ между ушами, чтобы кролик не пытался укусить провода.
10. Приложите пульсоксиметр плетизмограф к уху кролика над краевой ушной веной.
    заметка: Может потребоваться сбрить лишние волосы с уха для улучшения сигнала или использовать марлю, чтобы удерживать датчик на месте.
    1. Убедитесь, что частота сердечных сокращений на плетизмографии коррелирует с частотой сердечных сокращений по данным ЭКГ и что отображается сатурация кислорода (рис. 3C).
11. Аккуратно поместите маску для лица с трубкой капнографии на рот и нос кролика (рисунок 2H). Закрепите маску веревкой, обернутой вокруг маски, и прикрепите оба конца веревки к удерживающему устройству. Прикрепите другой конец трубки капнографии к монитору жизненно важных показателей><. заметка: Важно не допустить, чтобы веревка нависала над глазами кролика во время эксперимента. Для этого примотайте шнур к середине удерживающего устройства между ушами кролика. Чтобы улучшить сигнал капнографии, создайте односторонний клапан с помощью ленты и тонкого кусочка нитрила, который позволит кислороду проникать в Т-образный наконечник и будет направлять выдыхаемый CO2 в трубку капнографии (Рисунок 2I).

2. Запись видео-ЭЭГ-ЭКГ

1. Выполните видеозапись ЭЭГ-ЭКГ с помощью имеющегося в продаже программного обеспечения для ЭЭГ.
   заметка: Биопотенциальные отведения и видео блокируются по времени, чтобы позже коррелировать электрические и видеосигналы (например, всплеск ЭЭГ с миоклоническим рывком).
2. Обеспечьте оптимальное подключение без дрейфа базовой линии, электрического шума с частотой 60 Гц и с высоким соотношением сигнал/шум. В частности, убедитесь, что каждая фаза сердечного волны может быть визуализирована на ЭКГ и что дельта-, тета- и альфа-волны визуально не закрыты высокочастотным шумом на ЭЭГ.
   1. Если все электроды создают чрезмерное количество шума, отрегулируйте центральный опорный провод. Если только один электрод слишком шумный, протолкните его глубже в кожу или переместите его так, чтобы металл не был открыт
   .
3. Отрегулируйте видео так, чтобы все кролики были видны одновременно, что позволяет соотнести двигательную активность с результатами ЭЭГ (рис. 3A).
   заметка: Система обеспечивает одновременную запись ЭЭГ/ЭКГ/оксиметрии/капнографии от 7 кроликов.
4. Начните исходную запись от каждого животного в течение минимум 10-20 минут или до тех пор, пока частота сердечных сокращений не стабилизируется до спокойного, расслабленного состояния (200-250 уд/мин) и кролики не продемонстрируют больших движений в течение как минимум 5 минут. Получите электрографические данные с полной полосой пропускания без каких-либо фильтров. Чтобы лучше визуализировать данные, установите низкочастотный фильтр (=фильтр высоких частот) на частоту 1 Гц и высокочастотный фильтр (=фильтр низких частот) на частоту 59 Гц.
   заметка: Еще одним признаком того, что кролик расслаблен, является наступление ЭЭГ сонных веретен (обсуждается далее).
5. Добавляйте заметки во время эксперимента в режиме реального времени, чтобы указать время вмешательств (например, доставка лекарств) и нейрокардиальные события (например, всплеск ЭЭГ, моторные судороги, эктопическое биение и аритмии), а также артефакты моторики/исследователя.
   заметка: В связи с частотой, с которой исследователь должен применять вмешательство (например, фотостимуляция, доставка лекарств), чтобы свести к минимуму стресс, связанный с входом и выходом исследователя из комнаты и открытием/закрытием двери, исследователь остается на противоположной стороне комнаты на протяжении всего эксперимента. Следователь сидит как можно дальше от животного и остается неподвижным и тихим, чтобы свести к минимуму потенциальное беспокойство животных.

Результаты

Рисунок 1: Изображение электродов ЭЭГ и ЭКГ. (А) Изогнутые электроды для ЭКГ и прямые электроды для ЭЭГ. (Б) Как зацепить электрод ЭКГ в подкожной клетчатке кролика, чтобы он был насквозь. Сокращения (LL: левая конечность, RA: правая рука, RL: правая конечность, LA: левая рука, RF: правая лобная, LF: левая лобная, Cz: центр, RO: правая затылочная, LO: левая затылочна...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
компьютер	лощина	Опиплекс 5040	Компьютер сбора данных
Электрод для ЭКГ	РитмЛинк	RLSND116-2,5	13 мм, изогнутые под углом 35 градусов (диаметр 0,4 мм) подкожные штифтовые электроды
Электрод ЭЭГ	РитмЛинк	RLSP513	5-поворотные прямые 13 мм (диаметр 0,4 мм) подкожные штифтовые электроды
ЭГЕЛАБ (2020)	Центр вычислительной нейробиологии им. Шварца	Открытый доступ	Может выполнять спектральный анализ ЭЭГ
Адаптер Ethernet-to-Ethernet	Линксис	USB3G16	Адаптер для подключения фотоаппарата к компьютеру
Поролоновая прокладка	родовой	Н/Д	Снижает давление, оказываемое на шею маленьких кроликов ограничителем, чтобы предотвратить неблагоприятные кардиореспираторные эффекты компрессии шеи
MATLAB (R2019b, обновление 5)	Математические работы	Н/Д	Требуется для запуска EEGLAB
микрофон	Стереосистема Sony	ЭСМ-Д570П	Запись слышимых проявлений припадков
Микропористая медицинская лента, Бумага, Белая	3 МИН.	1530-1	Используется для фиксации проводов и создания ушной шины
Natus NeuroWorks	Натус	ЛК101-8	Программное обеспечение для сбора и анализа
Фотостимулятор	трава	PS22	Стимулятор для контроля частоты, задержки, длительности, интенсивности световых импульсов
Пластиковый органайзер для проводов / бандлер	12Vwire.com	ЛМ-12-100-БЛК	Пучок проводов для снижения уровня шума
PS 22 Фотостимулятор	Инструменты для травы	BZA641035	Стробоскоп с регулируемой частотой вспышки, задержкой и интенсивностью
Труба ПВХ	родовой	Н/Д	Предотвращает удары задних лап маленькими кроликами и травму позвоночника
Ограничитель для кроликов	Плас-Лабс	501-ТС	Доступны ограничители для кроликов различных размеров. 6" x 18" x 6" в этом исследовании.
Резиновая прокладка (бустер)	родовой	Н/Д	Поднимает маленьких кроликов вверх в удерживающем устройстве, чтобы предотвратить сдавливание шеи
Зажим для ушей SpO2	НОНИН	61000	Технология PureSAT/SpO2
Адаптер для датчика SpO2	НОНИН	13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Alcohol Prep, стерильный, большой, 2-х слойный	Ковидьен	5110	Подготовка ушной вены перед катетеризацией
LabChart Pro (2019, версия 8.1.16)	Приложения	Н/Д	Анализ ЭКГ
Квантовый усилитель	Натус	No 13926	Усилитель / дигитайзер
Усилитель Quantum HeadBox	Натус	No 22134	64-контактная коммутационная коробка
PTZ-камера SRG-X120 с разрешением 1080p и выходами HDMI, IP и 3G-SDI	сони	СРГ-Х120	Камера Impela