Выделение клеток IPE и RPE: методика получения глазных пигментных эпителиальных клеток из кроличьего глаза

Аннотация

Источник: Bascuas, T., et al. Выделение, культивирование и генная инженерия первичных пигментных эпителиальных клеток млекопитающих для невирусной генной терапии. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы показываем процедуру получения глазных пигментных эпителиальных клеток из модели кролика. Клетки полезны в разработке терапевтических стратегий для дегенеративных заболеваний сетчатки.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

Новозеландские белые кролики были усыплены путем передозировки пентобарбитала (150 мг/кг), разведенного в 0,9% NaCl, введенного внутрибрюшинно, и глаза были энуклеированы сразу после жертвоприношения.

1. Перед подготовкой

1. Приготовьте полнорационную среду (DMEM/Ham's F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 80 ЕД/мл пенициллина / 80 мкг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицина В). Нагрейте среду, 1x PBS и 0,25% трипсина (при необходимости) на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Положите стерильную простыню в вытяжку, чтобы подготовить асептическое рабочее место. Поместите все необходимые стерильные инструменты и материалы внутрь вытяжки.
   заметка: Только энуклеация глаз и очистка оставшейся мышечной ткани и кожи являются процедурами, проводимыми вне капюшона, остальные действия должны быть выполнены внутри капюшона.

2. Выделение ПЭ-клеток кролика

1. Используйте изогнутые ножницы и щипцы Colibri для энуклеации глаз после усыпления животного. Очистите остатки мышечной ткани и кожи с глаз с помощью ножниц и щипцов (нестерильных).
   заметка: Размер ножниц и щипцов, используемых для энуклеации и очистки глаз, зависит от вида (например, для крыс и мышей инструменты будут меньше, чем те, которые используются для свиней и крупного рогатого скота) (см. рис. 1).
   1. Соберите глаза в пробирку объемом 50 мл, заполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в колпак ламинарного потока. Продезинфицируйте глаза, погрузив на 2 минуты в раствор на основе йода, затем переложите их в чашку Петри, наполненную стерильным PBS.
2. Раскрытие луковицы
   1. Положите один глаз на стерильный марлевый компресс и крепко прижмите его к зрительному нерву. Откройте глаз с помощью скальпеля #11 и ножниц примерно на 2 мм под лимбом. Удалите передний сегмент (роговицу, хрусталик и радужную оболочку) и положите его в чашку Петри. Оставьте луковицу вместе со стекловидным телом до тех пор, пока не будут выделены клетки РПЭ.
3. Выделение клеток IPE
   1. Снимите линзу и тонкими щипцами аккуратно вытащите радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри, вымойте стерильным PBS и оставьте в PBS, пока не будет приготовлено больше ирисов. Удалите цилиарное тело с радужной оболочки, разрезав скальпелем #10.
   2. После приготовления 2 ирисов инкубировать с 1 мл 0,25% трипсина при 37 °С в течение 10 мин; за это время можно выделить клетки РПЭ (см. шаг 2.4). Удалите трипсин и добавьте 1 мл полной среды в радужную оболочку и изолируйте клетки, тщательно поцарапав плоской дозатором Пастера, отполированной огнем. Осторожно ресуспендируйте клетки с помощью пипетирования и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл. Возьмите 10 μл клеточной суспензии и разведите 1:3 с трипановым синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нейбауэра.
   3. Если трансфекцию не проводят немедленно, высейте 200 000 клеток/лунку в 24-луночный планшет (100 000 клеток/см²) в 1 мл полной среды (10% FBS) (посев см. в таблице 1). Поместите планшет в инкубатор и культивируйте его при температуре 37 °C, 5% CO2,
      заметка: Возможно, потребуется объединить несколько глазков, чтобы получить достаточное количество клеток для посева.
4. Выделение клеток РПЭ
   1. Удалите стекловидное тело и сетчатку с заднего сегмента с помощью тонких щипцов. Избегайте повреждения пигментного эпителия сетчатки.
   2. Положите стерильную марлю в 12-луночную тарелку и положите луковицу поверх марли.
   3. Постирайте с помощью PBS. Добавьте 50 мкл 0,25% трипсина на каждый глаз и инкубируйте в течение 10 мин при 37 °C. Удалите трипсин и добавьте 150 мкл готовой среды на каждый шарик и осторожно соскребите клетки РПЭ изогнутой пипеткой Пастера, отполированной огнем; Используйте тонкие щипцы для иммобилизации ткани. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в пробирку объемом 1,5 мл. Возьмите 10 μл клеточной суспензии; Разбавьте 1:4 трипановым синим, чтобы подсчитать ячейки в камере Нейбауэра.
   4. Центрифугируйте ячейки в течение 10 мин при 120 x g.
   5. Если трансфекцию не проводят немедленно, высейте 200 000 клеток/лунку в 24-луночный планшет (100 000 клеток/см²) в 1 мл полной среды (10% FBS) (посев см. в таблице 1). Поместите планшет в инкубатор и культивируйте его при температуре 37 °C, 5% CO2,
      заметка: Возможно, потребуется объединить несколько глазков, чтобы получить достаточное количество клеток для посева.

Результаты

вид	Лечение трипсином	N° Ячейки IPE	N° ячеек RPE	Пластина для посева (100 000 ячеек/см2)
кролик	да	~350,000	~2,500,000	24-луночные планшеты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-луночные планшеты	Корнинг	353043
24-луночные планшеты	Корнинг	353047
Бетадин	Мундифарма
Боннские микрощипцы плоские
Щипцы Colibri (стерильные)
DMEM/Радиолюбитель F12	Сигма-Олдрич	Д8062
Простыня (стерильная)	Mölnlycke Health Care	800530
ФБС	Бруншвиг	П40-37500
Щипцы (разного размера) (стерильные)
Марлевый компресс	ПРОМЕДИКАЛ АГ	No 25403
NaCl (0.9%)	Лаборатория Dr. Bichsel AG	1000090
Камера Нойбауэра	Мариенфельд-супериор	Номер 640010
Пипетка Пастера (огнеупорная)	Витег	4100150
ПБС 1Х	Сигма-Олдрич	Д8537
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич	П0781-100
Пентобарбитал (Тиопентал Инреса)	Ospedalia AG	31408025
чашка Петри	ThermoFisher Scientific	150288
Скарпель No10	Свон-Мортон	501
Скарпель No11	Свон-Мортон	503
Остро-острый кончик изогнутых ножниц Extra Fine Bonn (стерильные)
Остро-острый кончик прямых ножниц Extra Fine Bonn (стерильные)
Трипсин 0,25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Пружинные ножницы Vannas изогнутые (стерильные)