Выделение клеток IPE и RPE: метод получения пигментных эпителиальных клеток из изолированного глаза свиньи

Аннотация

Источник: Bascuas T. et al., Выделение, культивирование и генная инженерия первичных пигментных эпителиальных клеток млекопитающих для невирусной генной терапии. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы описываем метод выделения клеток радужной оболочки и пигментного эпителия сетчатки из глаз свиньи для получения их первичных культур для исследований in vivo и ex vivo. Эти пигментные клетки могут быть генетически модифицированы для изучения регенеративных подходов к лечению глазных заболеваний.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Перед подготовкой

1. Приготовьте полнорационную среду (DMEM/Ham's F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 80 ЕД/мл пенициллина / 80 мкг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицина В). Нагрейте среду, 1x PBS и 0,25% трипсина (при необходимости) на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Положите стерильную простыню в вытяжку, чтобы подготовить асептическое рабочее место. Поместите все необходимые стерильные инструменты и материалы внутрь вытяжки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только энуклеация глаз и очистка оставшейся мышечной ткани и кожи являются процедурами, проводимыми вне капюшона, остальные шаги должны быть выполнены внутри капюшона.
3. Свиные глаза были получены на местной скотобойне в течение 6 часов после жертвоприношения и доставлены в лабораторию на льду

2. Выделение свиных ПЭ-клеток

1. Используйте изогнутые ножницы и щипцы Colibri для энуклеации глаз после усыпления животного. Очистите остатки мышечной ткани и кожи с глаз с помощью ножниц и щипцов (нестерильных).
   заметка: Размер ножниц и щипцов, используемых для энуклеации и очистки глаз, зависит от вида (например, для крыс и мышей инструменты будут меньше, чем те, которые используются для свиней и крупного рогатого скота) (см. рис. 1).
   1. Соберите глаза в пробирку объемом 50 мл, заполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в колпак ламинарного потока. Продезинфицируйте глаза, погрузив на 2 минуты в раствор на основе йода, затем переложите их в чашку Петри, наполненную стерильным PBS.
   2. После переноса глаз в стерильную чашку Петри крепко прижмите один из них к зрительному нерву с помощью колибри или заостренных щипцов. Проделайте отверстие у края радужной оболочки (между pars plana и ora serrata) иглой 18 G. Вставьте маленькие ножницы в отверстие и разрежьте вокруг радужной оболочки. Удалите передний сегмент (роговицу, хрусталик и радужную оболочку) и положите его в чашку Петри. Оставьте луковицу вместе со стекловидным телом до тех пор, пока не будут выделены клетки РПЭ.

3. Выделение клеток IPE

1. Удалите цилиарное тело с радужной оболочки, разрезав скальпелем #10. После приготовления 2 ирисов добавьте 1 мл готовой среды и изолируйте клетки, тщательно поцарапав плоской отполированной огнем пипеткой Пастера. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл. Возьмите 10 μL клеточной суспензии и разведите 1:4 с трипановым синим, чтобы подсчитать клетки в камере Нейбауэра.
2. Если трансфекцию не проводят немедленно, высейте 200 000 клеток/лунку в 24-луночный планшет (100 000 клеток/см²) в 1 мл полной среды (10% FBS) (посев см. в таблице 1). Поместите планшет в инкубатор и культивируйте его при температуре 37 °C, 5% CO₂,
   заметка: Возможно, потребуется объединить несколько глазков, чтобы получить достаточное количество клеток для посева.

4. Выделение клеток RPE

1. Выполните шаг 1.1.1. Поместите луковицу в чашку Петри и промойте PBS. Заполните колбу 1 мл готовой среды.
2. С помощью изогнутой дозатора Пастера, отполированной огнем, осторожно удалите ячейки РПЭ. Обязательно соскрестите снизу вверх, чтобы избежать соскальзывания мембранного комплекса сосудистой оболочки Бруха. Соберите клеточную суспензию внутри колбы с помощью пипетки объемом 1 000 мкл и переложите в пробирку объемом 1,5 мл для повторного взвешивания. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и разведите трипановый синий в соотношении 1:8, чтобы подсчитать клетки в камере Нейбауэра.
3. Затравите клетки, как описано в шаге 3.2.

Результаты

вид	Лечение трипсином	N° Ячейки IPE	N° ячеек RPE	Пластина для посева (100 000 ячеек/см2)
свинья	Нет	~1,000,000	~3,000,000	24-луночные планшеты

...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-луночные планшеты	Корнинг	353043
24-луночные планшеты	Корнинг	353047
Бетадин	Мундифарма
Боннские микрощипцы плоские
Щипцы Colibri (стерильные)
DMEM/Радиолюбитель F12	Сигма-Олдрич	Д8062
ФБС	Бруншвиг	П40-37500
Щипцы (разных размеров) (стерильные)
NaCl (0.9%)	Лаборатория Dr. Bichsel AG	1000090
Игла (18G)	Терумо	TER-NN1838R
Камера Нойбауэра	Мариенфельд-супериор	Номер 640010
Пипетка Пастера (огнеупорная)	Витег	4100150
ПБС 1Х	Сигма-Олдрич	Д8537
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич	П0781-100
чашка Петри	ThermoFisher Scientific	150288
Скарпель No10	Свон-Мортон	501
Скарпель No11	Свон-Мортон	503
Остро-острый кончик изогнутых ножниц Extra Fine Bonn (стерильные)
Остро-острый кончик прямых ножниц Extra Fine Bonn (стерильные)
Цитометр на основе изображения Tali	ThermoFisher Scientific	Т10796
Трипсин 0,25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Трипсин 5% / ЭДТА 2%	Сигма-Олдрич	Т4174
Пружинные ножницы Vannas изогнутые (стерильные)