Модель бактериального кератита роговицы свиньи ex vivo: методика выявления бактериальной инфекции в эпителиальных клетках роговицы

Аннотация

Источник: Okurowska, K., et al. Создание модели роговицы свиньи ex vivo для изучения медикаментозных методов лечения бактериального кератита. J. Vis. Exp (2020).

В этом видео описывается протокол создания модели ex vivo для бактериального кератита с использованием корнеосклеральной кнопки, рассеченной из свиного глаза. Инокулированные бактерии проникают через разрезы эпителия роговицы, проникая в нижележащую строму и создавая инфекцию в тканях роговицы, которая имитирует инфекцию in vivo.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE

1. Приготовление инокулята

1. Налейте 10 мл бульона LB в коническую колбу объемом 50 мл с пенной пробкой.
2. Перенесите колонию P. aeruginosa штамма PAO1 или штамма PA14 из свежей агаровой тарелки и инкубируйте при 37 °C в течение 3-4 часов, пока бактерии не перейдут в среднюю фазу логарифма.
3. Перенесите культуру бактерий в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 3000 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS.
4. Повторите шаг 1.3 еще два раза, чтобы промыть клетки. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в PBS и отрегулируйте оптическую плотность при 600 нм примерно до 0,6, используя стерильный PBS в качестве заготовки.

2. Заражение корнеосклеральной кнопки

1. Удалите среду из чашки Петри и дважды промойте роговицу 1 мл стерильного PBS.
2. Аккуратно сожмите щипцы, удерживая роговицу между ними. С помощью скальпеля 10А сделайте четыре надреза - два вертикальных и два горизонтальных - в центральной части корнеосклеральной пуговицы через эпителиальный слой к нижележащей строме.
3. Поместите стерильную стеклянную форму в 6-луночную пластину широкой стороной вверх и поместите роговицу в середину стеклянной формы эпителиевой стороной вниз. Сделайте надрез прямо по центру нижней части стеклянной формы.
4. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Залейте 1 мл 1% (по массе) агара с низкой температурой плавления, растворенного в DMEM, чтобы полностью заполнить стеклянную форму роговицей.
5. Дайте агару застыть, а затем переверните стеклянную форму так, чтобы эпителий роговицы был обращен вверх.
6. Пипеткой нанесите 15 мкл бактериальной культуры с наружным диаметром_{600 нм} = 0,6 (для P. aeruginosa это соответствует примерно 1 x 10⁷ колониеобразующим единицам (КОЕ) в 15 мкл) непосредственно в область разреза, а затем добавьте 85 мкл PBS сверху, чтобы эпителий роговицы оставался влажным. Разбавьте оставшуюся бактериальную культуру и нанесите на агар для подсчета колониеобразующих единиц для инокулюма.
7. Добавьте по 1 мл DMEM без антибиотиков на дно каждой лунки со стеклянной формой. Инкубируйте 6-луночный планшет с инфицированными корнеосклеральными пуговицами во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 часов.
8. Устанавливайте неинфицированную контрольную роговицу вместе с каждым экспериментом. Чтобы установить контроль над неинфицированными, замените 15 мкл бактериальной культуры на этапе 2.6 стерильным PBS.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пробирка Falcon 50 мл	Технология SLS	No 352070 (Английский
Амфотерицин В	сигма	А2942
Пластина Cellstar на 12 лунок	Greiner Bio-One	665180 (Английский
декстран	сигма	31425-100мг-Ф
Дистель	Научный центр Фишера	12899357
DMEM + глутамакс	Технология SLS	Д0819
Инкубатор с двумя духовками	Технология SLS	ОВе1020	Стерилизационная печь
Эпидермальный фактор роста	Технология SLS	Э5036-200УГ
ВЕТЧИНА F12	сигма	Н4888
Эмбриональная сыворотка для теленка	Лабтех Интернэшнл	СА-115/500
щипцы	Научный центр Фишера	15307805
Heracell VIOS 160i	Термо Сайентиал	15373212	Инкубатор для тканевых культур
Инсулин рекомбинантный человеческий	Технология SLS	91077С-1Г
ЛБ агар	сигма	Л2897
Мультитрон	Инфорс	Не применяется	Бактериальный инкубатор
ПБС	Технология SLS	П4417
Пенициллин-стрептомицин	Технология SLS	П0781
чашка Петри	Научный центр Фишера	12664785
Чашка Петри 35x10мм CytoOne	Старлаб	СС7672-3340
Повидон-йод	Аптека Weldricks	2122828
Сейф 2020	Научный центр Фишера	1284804	Микробиологический шкаф безопасности класса II
Лезвие скальпеля No15	Научный центр Фишера	О305
Скальпель Swann Morton	Научный центр Фишера	11849002

) )