Ex vivo модель биопленки в легких свиньи: методика разработки модели легких для изучения бактериальных биопленок в бронхиолярной ткани свиньи

Аннотация

Источник: Harrington, N.E. et al., Тестирование эффективности антибиотика в модели ex vivo биопленок Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в легких с муковисцидозом. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео описывается протокол разработки ex vivo модели бактериальной биопленки свиньи на инфицированной бронхиолярной ткани. Биопленки представляют собой бактериальные агрегаты, встроенные в матрицу, прилегающую к поверхности. Данная модель используется для изучения антибиотикочувствительности бактерий на разных стадиях формирования биопленки.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Диссекция и инфекция ткани легкого свиньи ex vivo (EVPL)

1. Приготовьте SCFM для использования с тканями EVPL, следуя рецепту 1 л модифицированного SCFM, приведенному в таблице 1.
2. Перед вскрытием подготовьте агаровую пластину (пластины) необходимого бактериального штамма (штаммов) для инфекции с использованием любого стандартного агара в лаборатории для P. aeruginosa/S. aureus (например, лизогенный бульон + 1,2% агар).
3. Рассчитайте, сколько кусочков бронхиолярной ткани свиньи требуется для эксперимента, включая неинфицированные кусочки контрольной ткани. Умножьте это число на два, чтобы повторить эксперимент в двух повторяющихся легких для подтверждения повторяемости результатов.
4. Умножьте общее количество необходимых кусочков ткани на 0,5, чтобы определить объем агарозы SCFM (мл), необходимый для изготовления агарозных прокладок, чтобы получить достаточное количество среды для 400 мкл/кусочек ткани плюс запасной агар SCFM для учета любых ошибок пипетирования или испарения во время приготовления.
5. Добавьте 0,12 г агарозы на каждые 15 мл SCFM, необходимые для получения желаемого общего объема SCFM с 0,8% по весу/объему агарозы.
6. Нагрейте раствор агарозы SCFM до полного растворения агарозы. Рекомендуется использовать домашнюю микроволновую печь на малой мощности. Необходимое время зависит от мощности микроволновой печи. Дайте агарозе остыть примерно до 50 °C (теплая на ощупь, но удобная для удержания). Не дайте остыть дальше.
7. С помощью пипетки добавьте 400 мкл агарозы SCFM в одну лунку 24-луночного планшета на каждый необходимый кусок ткани.
8. Стерилизовать 24-луночный планшет (планшеты) с агарозой SCFM под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут.
9. Приготовьте три повторных промывки для каждого интактного легкого, рассекаемого с использованием 20 мл стерильной модифицированной среды Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco плюс 20 мл стерильной Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением ампициллина 50 мкг/мл.
10. Сделайте аликвоту 40 мл SCFM в качестве заключительного промывания для каждого неповрежденного легкого, которое препарируется. Все стирки можно хранить в течение ночи при температуре 4 °C или использовать сразу.
11. Как можно скорее после убоя получите легкие из указанного источника, обеспечив их хранение в холоде, транспортировав в лабораторию в бытовом холодильнике><. заметка: Легкие ближе ко дню убоя имеют меньше синяков от хранения, но ткани, хранящиеся в холодильнике до 4 дней после убоя, также могут быть использованы. Поскольку холодильник необходимо доставить в мясную лавку или на скотобойню, его необходимо обеззараживать в соответствии с местными лабораторными рекомендациями после каждого использования и хранить за пределами микробиологической лаборатории, когда он не используется, чтобы снизить риск заражения и нарушения условий локализации.
12. Работая на стерилизованной поверхности и под огнем, поместите легкие на чистую пластиковую разделочную доску, покрытую автоклавной алюминиевой фольгой. Проверьте, чтобы бронхиолы остались неповрежденными. Если на скотобойне или во время транспортировки произошли какие-либо повреждения, легкие не пригодны для использования.
13. Нагрейте мастихин под пламенем и очень кратковременно прикоснитесь ножом к области легкого, окружающей бронхиолу для стерилизации поверхности ткани.
14. Отрежьте поверхностные ткани, окружающие бронхиолу, с помощью стерильного бритвенного лезвия. Делайте надрезы параллельно бронхиоле, чтобы предотвратить их повреждение.
15. После того, как бронхиола будет обнажена, сделайте поперечный разрез через бронхиолу в самой высокой видимой точке, чтобы освободить бронхиолу.
16. С помощью стерильных щипцов слегка возьмитесь за свободный конец бронхиолы и отрежьте остатки ненужной ткани с помощью стерильного бритвенного лезвия. Сделайте окончательный поперечный разрез поперек бронхиолы, прежде чем станет видно какое-либо разветвление, чтобы удалить бронхиолу из легких.
17. Поместите бронхиолу в первую стирку DMEM/RPMI 1640. Оставьте бронхиолу в промывке и повторите шаги с 1.12 по 1.15, чтобы собрать дополнительные участки бронхиолы из того же легкого, как это требуется, чтобы получить достаточное количество срезов ткани для запланированного эксперимента.
18. Поместите в промывку все дополнительные бронхиолярные срезы из того же легкого (шаг 1.17). Оставьте в стирке минимум на 2 минуты.
19. Удалите бронхиолы из первой промывки DMEM/RPMI 1640 и поместите образцы в стерильную чашку Петри.
20. Слегка держите каждую бронхиолу с помощью стерильных щипцов, следя за тем, чтобы не повредить ткань. Удалите как можно больше оставшихся мягких тканей и разрежьте ткань на полоски шириной ~5 мм с помощью стерильных ножниц для препарирования.
21. Поместите все полоски бронхиолярной ткани во вторую полоску для мытья DMEM/RPMI 1640. Оставьте в стирке минимум на 2 минуты.
22. Удалите полоски ткани со второго промывания с помощью стерильных щипцов, стараясь не повредить ткань. Поместите салфетку в чистую стерильную чашку Петри.
23. Удалите остатки мягких тканей, прикрепленных к бронхиоле, и разрежьте полоски на квадраты (~5 мм x 5 мм) с помощью стерильных ножниц для препарирования.
24. Добавьте третью промоушку DMEM/RPMI 1640 в чашку Петри. Слегка перемешайте кусочки ткани в смывке, поворачивая посуду.
25. Третью смывку вылейте из чашки Петри, не удаляя кусочки ткани.
26. Добавьте окончательную промывку SCFM в чашку Петри, содержащую салфетки, убедившись, что все кусочки салфетки покрыты.
27. Стерилизуйте кусочки ткани в СКФМ под ультрафиолетовым излучением в течение 5 минут.
28. С помощью стерильных щипцов перенесите каждый стерилизованный кусочек бронхиолярной ткани в отдельные лунки 24-луночного планшета/планшетов, содержащих агарозные прокладки SCFM.
29. Чтобы заразить каждый кусочек ткани желаемым штаммом бактерий, прикоснитесь к колонии, выращенной на агаровой пластине, кончиком иглы массой 29 г, прикрепленной к стерильному инсулиновому шприцу объемом 0,5 мл. Затем прикоснитесь колонией к кусочку ткани, осторожно прокалывая поверхность ткани.
    заметка: Использование инсулинового шприца, оснащенного иглой 29 G, позволяет точно и удобно держать иглу, сохраняя при этом пальцы на безопасном расстоянии от иглы и легочной ткани. Выполнить этот этап можно с помощью игл 29 G, которые не прикреплены к шприцу, но это требует большей ловкости и увеличивает риск травмы от укола иглой. Инсулиновые шприцы легко доступны.
30. Для неинфицированных контрольных групп осторожно проколите поверхность каждого кусочка ткани кончиком иглы 29 G, прикрепленной к стерильному инсулиновому шприцу объемом 0,5 мл.
31. С помощью пипетки добавьте 500 μL SCFM в каждую лунку.
32. Стерилизуйте дышащую герметизирующую мембрану для каждой 24-луночной пластины под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут (Таблица материалов).
33. Снимите крышку с 24-луночной пластины и замените ее дышащей мембраной.
34. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение желаемого времени инкубации (заражения) без встряхивания. Убедитесь, что на неинфицированных контрольных образцах нет видимого роста инокулированного патогена (контроль загрязнения).
    заметка: При желании ампициллин может быть добавлен в агарозные прокладки SCFM и покрывающие SCFM на стадии 1.31 до конечной концентрации 20 мкг/мл. Это будет подавлять рост большинства эндогенных бактерий в легких, не влияя на рост P. aeruginosa или S. aureus, но, поскольку присутствие ампициллина может повлиять на чувствительность к другим антибиотикам, читателю остается сделать этот выбор в зависимости от штаммов и антибиотиков, которые он хочет протестировать.

ТАБЛИЦА 1

1. Приготовление синтетической среды мокроты CF (SCFM) для использования с моделью легких свиньи ex vivo

После изготовления, SCFM должен быть стерилизован фильтром, а затем может храниться при температуре 4°C до одного месяца.

мм См.

a) Основной рецепт
Шаг 1	химический	количество	резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	NaCl	3,03 г	Добавьте соли и воду в чистую бутылку, используется только для приготовления SCFM	51,85
	KCl	1.114 г		14.94
	dH2O	640 мл		Н/Д
Шаг 2	химический	Молярность бульона изготавливается в воде, стерилизуется фильтром и хранится при температуре 4°C	резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	На2НПО4	0,125 млн	Добавьте по 10 мл каждого бульона в соли и воду, приготовленные на шаге 1	1.25
	НаН2ПО4	0,13 млн		1.30
	NH4Cl	0.228 млн		2.28
	КНОТ3	0,0348 млн		0,35
	К2СО4	0,0271 млн		0,27
	Швабры	1 М		10.00
Шаг 3	химический		резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	19 растворов аминокислот, приготовленных в соответствии с разделом b)		Добавьте по 10 мл каждого бульона в раствор, приготовленный на этапах 1 и 2.	раздел b)
Шаг 4	Химическая промышленность		резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	HCl или NaOH по мере необходимости		Используйте для регулировки рН раствора, приготовленного на шагах с 1-3 по 6,8. Добавлен рекордный объем кислотно-щелочных веществ.	Н/Д
Шаг 5	Химическая промышленность		резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	dH2O		Добавить в раствор, приготовленный на этапах 1-4, до конечного объема 960 мл	Н/Д
Шаг 6	химический	Молярность бульона изготавливается в воде, стерилизуется фильтром и хранится при температуре 4°C	резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	CaCl2	0,175 млн	Добавьте по 10 мл каждого бульона в раствор, приготовленный на шагах 1-5	1,75
	MgCl2	0,0606 млн		0,61
Шаг 7	химический	Молярность бульона изготавливается в воде, стерилизуется фильтром и хранится при температуре 4°C	резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	L-молочная кислота	0,93 млн	Сделайте бульон в воде, pH до 7 с 5М NaOH. Добавьте 10 мл в раствор, приготовленный с этапами 1-6.	9.30
Шаг 8	химический	Молярность рабочего посуды производится в воде, непосредственно перед добавлением в рецептуру	резолюция	Итоговый мМ в 1л SCFM
	Fe(III)SO4.7H2O	0,00036 М	Изготовьте эталонный запас объемом 0,036 М, который можно стерилизовать фильтром и хранить при температуре 4°C до тех пор, пока в растворе не будет осаждать. Чтобы сделать заготовку, добавьте 110 μл исходной массы в 9,890 мл dH2O и добавьте рабочую массу в раствор, приготовленный на этапах 1-7.	0,0036

См. см. См. мм См. См. См. См. мм См. См. См. См.

b) Подготовка запасов аминокислот; фильтр стерилизуют перед использованием и хранят при температуре 4°C.
аминокислота	Акция mM	резолюция	Итоговый мМ в 1 л SCFM
Аланин	178	Растворить в воде	1.780
аргинин	30.6	Растворить в воде	0,306
Аспартат	82,7	Растворить в 0,5 м NaOH	0,827
цистеин	16	Растворить в воде	0.160
Глутаминовая кислота	154,9	Растворить в 1 М HCl	1,549
глицин	120.3	Растворить в воде	1.203
Гистидин	51,9	Растворить в воде	0.519
Изолейцин	112,1	Растворить в воде, нагрев до 50°C в течение 30 минут на шейкере	1.121
лейцин	160,9	Растворить в воде	1,609
лизин	212,8	Растворить в воде	2.128
метионин	63.3	Растворить в воде	0,633
Орнитин-гидрохлорид	67,6	Растворить в воде	0.676
Фенилаланин	53	Растворить в воде	0.530
Пролин	166	Растворить в воде	1.660
серин	144,6	Растворить в воде	1,446
треонин	107,2	Растворить в воде	1,072
триптофан	1.3	Растворить в 0,2 м NaOH	0,013
тирозин	80,2	Растворение в 1М NaOH	0,802
Валин	111,7	Растворить в воде	1.117

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инсулиновые шприцы - 0,5 мл с прикрепленной иглой 29G.	ВВР	BDAM324892
24-луночные планшеты для культивирования
70% этанол или аналогичный для стерилизации поверхностей и сжигания оборудования для вскрытия
Агаровые пластинки для получения прожилок P. aeruginosa/S. aureus (любая подходящая среда)
агароза
Алюминиевая фольга - предварительно стерилизованная автоклавированием - для покрытия разделочной доски, на которой вы будете препарировать легкие.
Уплотнительная мембрана Breathe-easy или Breathe-easy для многолуночных планшетов	Диверсифицированная биотехнология	БЭМ-1 или БЕРМ-2000
Горелка Бунзена
Разделочная доска - мы рекомендуем пластиковую доску, чтобы обеспечить легкую дезинфекцию спиртом.
Холодильник для транспортировки легких в лабораторию
Ножницы для вскрытия разных размеров
Модифицированная среда Eagle от Dulbecco (DMEM)
Большой мастихоножка
Навесные бритвенные лезвия
Чашки Петри
Пластиковая разделочная доска и алюминиевая фольга для создания стерильной и очищаемой поверхности для вскрытия
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 средний
СКФМ			Ингредиенты, перечисленные в Таблице 1
Выбор щипцов (рекомендуются тупые кончики)
Подходящие контейнеры для утилизации загрязненных острых предметов и легочной ткани свиньи, в соответствии с < / > вашего учреждения Политика в области охраны труда и техники безопасности.