$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Рассечение ткани
- Подготовьте ткань свиньи с помощью нестерильного рабочего места для препарирования.
- Приобретите энуклеированные свиные глаза на местной скотобойне, в исследованиях на животных или у поставщика. Держите глаза на льду, погруженном в PBS во время доставки, и используйте сразу после получения.
- Отрежьте экстраорбитальную ткань и обрежьте конъюнктиву, оставив только корнеосклеральную оболочку и зрительный нерв. Выполняйте диссекцию в нестерильных условиях с помощью больших хирургических ножниц и щипцов в наборе инструментов для грубой диссекции.
- Поместите глаза обратно в свежую PBS на льду до тех пор, пока все глаза, необходимые для экспериментальной установки, не будут предварительно препарированы.
- Погрузить глаза в 10% раствор бетадина на 2 мин в закрытые емкости и асептически перенести в кабинет BSC II для микродиссекции (шкаф #1). Выполняйте все последующие работы в стерильных условиях, чтобы свести к минимуму загрязнения во время установки.
- Стерильно рассекайте передние сегменты.
- Через 2 минуты в растворе бетадина перенесите глаза в три последовательных промывки стерильным 1x Антибиотик-Антимикотик-ПБС (AA-PBS) для удаления избытка раствора бетадина с поверхности глаза при сохранении стерильности глазной ткани. После трех стирок сохраняйте салфетку в AA-PBS до дальнейшего использования.
- Гемисекируйте глаз с помощью бритвенного лезвия/скальпеля и изогнутых ножниц. Поместите глаз на марлю, пропитанную AA-PBS, и сделайте разрез стерильным лезвием бритвы или скальпелем рядом с экватором глаза (разделение 60/40 с 40 на передней стороне). С помощью изогнутых хирургических ножниц проведите гемисекцию глаза, чтобы изолировать передний глаз (половину роговицы).
заметка: Разрез вокруг переднего сегмента должен быть непрерывным, чтобы предотвратить неровные, шероховатые края склеры, которые создадут утечки жидкости после вправления в культуре органа.
- Используйте микроножницы в качестве лопаты, чтобы зачерпнуть стекловидное тело из переднего сегмента. Снимите линзу с переднего отрезка с помощью микроножниц. Оставьте передние сегменты в AA-PBS до дальнейших этапов диссекции.
заметка: Все глаза, которые будут препарированы, можно удерживать на этом этапе и один за другим проводить через оставшуюся часть процесса препарирования.
- С помощью препарирующего микроскопа обрезайте радужную оболочку до корня радужной оболочки постепенно, радиально, пока не станет видна трабекулярная сеть (ТМ). ТМ представляет собой пигментированную ткань, состоящую из волокон, ориентированных по окружности вокруг корнеосклеральной оболочки. Осторожные надрезы на радужной оболочке по направлению к корню ириса обнажат глубину ТМ под тканью.
- Разрежьте на 360° вокруг радужной оболочки на той же глубине, что и первоначальный разрез в ткани, чтобы обнажить всю область ТМ. При необходимости уберите остатки радужной оболочки, покрывающие ТМ.
- Обрежьте остатки цилиарного тела позади ТМ, оставив только тонкую полосу ткани позади области ТМ (примерно 1 мм).
- Поместите рассеченный передний сегмент (AS) в среду до дальнейшей установки в культуру органов переднего сегмента (ASOC) в шкаф для сборки чашки BSC II (шкаф #2).
заметка: Все глаза могут быть удержаны на этом этапе до установки ASOC, если один пользователь выполняет вскрытие и сборку чашки для культивирования органов.