Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Установка передних сегментов в чашках для культивирования органов
- Поместите один передний сегмент (AS) в чашку Петри с перевернутой AS (чашкой вверх). С помощью ватного тампона смочите в среду и аккуратно похлопайте по центру роговицы, чтобы удалить пигмент. С помощью щипцов для удержания глаза и того же тампона протрите ватным тампоном вокруг склеры, чтобы удалить лишний пигмент.
- Переверните AS и поместите его поверх нижней части чашки над возвышенной областью, центрируя роговицу над возвышенной областью в чашке. Поместите зажимное кольцо поверх только что установленного AS.
- Вставьте четыре винта в соответствующие отверстия, чтобы удерживать кольцо на месте с AS под кольцом. Аккуратно затяните винты вручную с помощью L-образного ключа.
заметка: Этап затяжки будет происходить ежедневно на протяжении всего эксперимента, поэтому цель первоначальной затяжки здесь — убедиться, что среда не протекает, избегая при этом поломки зажимного кольца.
- С помощью стерильного набора чашек Петри поместите верхнюю часть над чашкой и переверните сетку. Прикрепите подставку для посуды. Прикрепите жидкостные соединители с уплотнительными кольцами к резьбовым портам на дне посуды.
- К одному жидкостному соединителю прикрепите изогнутую ступицу иглы 18 G 90°, отрезок трубки, ступицу иглы 18 G, нейлоновый шприцевой фильтр, трехходовой клапан и шприц объемом 20 мл, заполненный фильтрующим материалом.
- Ко второму жидкостному соединителю прикрепите изогнутую на 90° иглу 18 G, длину трубки, ступицу иглы 18 G, трехходовой клапан и цилиндрическую часть стерильного шприца объемом 10 мл (он будет действовать как резервуар для сбора жидкости и пузырьков из ASOC).
- Открыв трехходовые клапаны для шприцев, осторожно протолкните фильтрующий материал через систему с помощью порта разъема fluidics, указанного на шаге 1.5, чтобы накачать AS, заполнить среду в трубке и, в конечном итоге, в резервуаре><.
заметка: Если среда просачивается в чашку ASOC, АС недостаточно плотно фиксируется зажимным кольцом.
- Удалите пузырьки, осторожно вдавливая материал в чашку и переворачивая чашку, чтобы вытолкнуть пузырьки в резервуар.
- Поставьте блюдо на место и встаньте прямо. Поместите нижнюю часть чашки Петри под ножки подставки, осторожно, чтобы не зацепить трубку.
2. Начало культуры органов переднего сегмента
- Теперь ASOC готов к инкубации. Поместите чашку ASOC в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%CO2). Убедитесь, что высота чашки ASOC в инкубаторе над датчиками давления известна и учтена для точного расчета внутриглазного давления (ВГД).
- Направьте трубопроводки наружу через нижнюю часть дверцы инкубатора с температурой 37 °C и 5%CO2, чтобы они не мешали открыванию и закрытию дверцы. Присоедините шприц объемом 20 мл к набору шприцевых насосов со скоростью 2,5 мкл/мин.
- Расположите трубопровод НКТ вместе с резервуаром на приборе датчика давления. Подсоедините боковой 3-ходовой клапан к преобразователю давления во время подачи PBS по трубопроводу, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в трубопроводы.
заметка: Опорожняйте PBS из резервуаров после настройки системы, чтобы снизить вероятность загрязнения резервуара микробным ростом в течение всего периода культивирования органов.
- Чтобы начать сбор данных IOP, сначала убедитесь в наличии карта microSD для сохранения файлов данных. Затем включите настройку датчика давления, чтобы начать сбор данных.
3. Ежедневное обслуживание ASOC
- После того как ASOC даст 24 часа на балансировку, извлеките чашки из инкубатора с температурой 37 °C и 5%CO2 и поместите их в шкаф биобезопасности (BSC) II><.
заметка: При сборе данных о давлении эти временные периоды выглядят как пики, поскольку ASOC извлекаются из инкубатора (изменение высоты) и регулируются в шкафу.
- Проверьте наличие утечек под каждой посудой на тарелке Петри. Если они присутствуют, проверьте наличие плотных жидкостных соединений под чашкой и при необходимости затяните их снова. Проверьте наличие утечек в крышке посуды с помощью стерильного L-образного ключа, чтобы затянуть винты в зажимном кольце.
заметка: Ткань склеры AS сжимается и уменьшается толщина на 24 часа, и зажимное кольцо необходимо затянуть.
- Хорошо отсасывайте среду из чашки.
заметка: Трабекулярная сетка фильтрует жидкость из среды, закачиваемой в ASOC. Поэтому в чашке ASOC по краям будут присутствовать медиа.
- Повторите шаги 1.7 и 1.8, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха.
- Заправьте шприцы на шприцевых насосах, убедитесь, что шприцевые насосы работают, и подтвердите выравнивание клапанов для перфузии в ASOC. Верните чашку ASOC в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2.
заметка: Оптимально, чтобы эти действия выполнялись ежедневно. Тем не менее, использование начального объема среды 20 мл, объема лунки ASOC и скорости насоса 2,5 мкл/мин должно быть достаточным для бесперебойной работы системы в течение нескольких дней.
