Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Разрезание тканей сердца свиньи
- Установите тканевую ванночку на вибратом, добавьте лед в охлаждающую рубашку тканевой ванны, затем добавьте раствор Tyrode в тканевую ванну. Установите пластиковую банку объемом 1 л для сбора расплавленного льда из ткани ванны охлаждающей рубашки. На 1 л нарезки раствора Tyrode смешать 3 г/л 2,3-бутандиона моноксиме (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкозы (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М раствора), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М раствора), до 1 л ddH2O. Отрегулируйте pH до 7,40 с помощью NaOH. Затем отфильтруйте раствор с помощью вакуумного фильтра/системы хранения объемом 1 000 мл, 0,22 мкм, и храните при температуре 4 °C в течение ночи.
- Под шкафом биобезопасности переложите сердце свиньи в лоток, содержащий 1 л свежего холодного кардиоплегического раствора. На 1 л кардиоплегического раствора смешайте 110 мМ NaCl (6,43 г), 1,2 мМ CaCl2 (1,2 мл 1 М раствора), 16 мМ KCl (1,19 г), 16 мМ MgCl2 (3,25 г), 10 мМ NaHCO3 (0,84 г), 1 Ед/мл гепарина, до 1 л ddH2O. Отрегулируйте pH до 7,40 с помощью NaOH. Затем отфильтруйте раствор с помощью вакуумного фильтра/хранилища объемом 1 000 мл, 0,22 мкм, и храните при температуре 4 °C в течение ночи><.
заметка: Добавьте 1000 Ед/л гепарина в раствор для кардиоплегии в день нарезки.
- Препарируйте сердце, чтобы изолировать левый желудочек с помощью выдвижных стерильных скальпелей. Затем разрежьте левый желудочек на блоки по 1−2 см3 каждый с помощью лезвий в виде бритвенного прямоугольника. Используйте один кусок для нарезки, а оставшиеся кусочки храните в пробирке объемом 50 мл в холодном растворе Tyrode на льду для последующего нарезки, если это необходимо.
заметка: Массируйте ткани перед нарезкой руками, особенно если это второй блок. Массаж помогает восстановить правильную конфигурацию мышечных волокон и предотвращает любую скованность в сердечном блоке.
- Добавьте 1−2 капли тканевого клея (Таблица материалов) в металлический держатель образца и приклейте кусочек блока 4% агара с площадью поверхности примерно 1 см2 .
- Добавьте 1−2 капли тканевого клея на агар.
- Приклейте сердечный блок к агару стороной сердечного эпикарда вниз на тканевый клей и убедитесь, что он максимально плоский. Затем перенесите держатель салфетки с блоком сердца на его место в ванне для нарезки вибратома.
- Подсоедините кислородную трубку к ванне для нарезки и металлическому лотку, наполненному раствором Тайроде для сбора ломтиков (насыщенная кислородом ванна Тайрода). Затем добавьте в металлический лоток ситечки размером 40 мкм, чтобы собрать ломтики после нарезки.
- Регулировка положения нарезки
- С помощью программного обеспечения для управления вибратомом и приборной панели отрегулируйте высоту лезвия/образца. Выберите кнопку высоты и следуйте инструкциям на экране по регулировке высоты. В идеале лезвие должно быть близко к верхней части ткани, но ниже сосочковых мышц, и перед разрезанием убедитесь, что ткань и лезвие покрывает жидкость.
- Отрегулируйте, с чего начать нарезку ткани, нажав кнопку «Ускорить». Нажмите кнопку среза и увеличьте скорость с помощью ручки, чтобы переместить лезвие к краю ткани. Затем нажмите кнопку «Разрезать» еще раз, чтобы остановиться, и нажмите кнопку «Вперед», чтобы деактивировать процесс.
- Отрегулируйте параметры резки: скорость продвижения = 0,03 мм/с, частота вибрации = 80 Гц, амплитуда горизонтальной вибрации = 2 мм. Затем начните нарезку, нажав кнопку «Нарезать».
- Дайте вибратому разрезать, пока он не достигнет конца ткани, но до того, как он достигнет заднего конца держателя образца. На этом этапе нажмите кнопку «Нарезать» еще раз, чтобы остановиться. Нажмите кнопку «Возврат», чтобы вернуться в исходное положение.
- Выберите «Автоповтор» (кликнув по нему дважды), что позволит вибрирующему микротому автоматически повторять процесс нарезки до 99 раз.
- Сбор срезов
- Подождите, пока ломтики станут полной длины и не станут хорошо выглядеть (после того, как пройдут сосочковые мышечные слои), затем начните собирать ломтики.
- Соберите срезы с помощью пластиковой пастеровской пипетки, наполненной холодным раствором Тирода, чтобы аккуратно взять ткань из ванны. При необходимости с помощью щипцов и пружинных ножниц можно отделить срез от сердечного блока, если ткань все еще прикреплена.
- Переложите срез в одно клеточное ситечко в насыщенной кислородом ванне Tyrode (см. шаг 1.7) и используйте жидкость из пластиковой пипетки Пастера, чтобы ткань лежала ровно на одном из клеточных фильтров, затем добавьте сверху металлическую шайбу, чтобы удерживать ткань внизу.
