Выделение комплекса кучевых ооцитов свиньи: метод выделения комплекса кучевых ооцитов из фолликула яичников свиньи для экстракорпорального оплодотворения

Аннотация

Источник: Gorczyca, G. et al., Протеолитически деградировавшие альгинатные гидрогели и гидрофобные микробиореакторы для инкапсуляции свиных ооцитов. J. vis. Exp. (2020).

Это видео описывает метод выделения кумулюс-ооцитарного комплекса или COC из яичников свиней. Изолированный интактный КОК может быть использован для проведения экстракорпорального оплодотворения - метода вспомогательной репродукции для разработки методов лечения бесплодия.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение свиных кумулюс-ооцитарных комплексов

1. Чтобы собрать материал для выделения фолликулов яичников, удалите яичники свиней из свинок препубертатного возраста (примерно 6-7-месячного возраста, весом от 70 до 80 кг) на местной скотобойне. Выберите примерно 20 яичников свиньи от 10 животных для выделения кумулюс-ооцитарных комплексов (КОК) в каждом эксперименте.
   заметка: Если предположить, что каждый яичник дает 3–5 фолликулов, то общее количество фолликулов варьируется от 60 до 100.
2. Поместите яичники в термос со стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,4; 38 °C), содержащим 1% антимикотический раствор (AAS). В течение 1 ч экспериментальный материал транспортируется в лабораторию, где его дважды промывают стерильным PBS, содержащим антибиотики.
3. После промывки яичников переложите их в стакан, наполненный рабочей средой (HM) (Table of Materials) и храните в инкубаторе при температуре 38 °C на время всех манипуляций><. заметка: Для достижения оптимальных результатов при работе с ооцитами проводите все процедуры в среде DMEM/F12 (рабочая среда, HM) с добавлением 2,5% антибиотика/AAS и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и контролируйте pH на уровне CO₂ в окружающей среде, на нагревательном столе с контролем температуры (38 °C) и под ламинарным проточным колпаком для минимизации бактериального загрязнения.
4. Из крупных фолликулов свиньи (6-8 мм в диаметре) соберите фолликулярную жидкость (СЖ) путем аспирации и центрифугирования при 100 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого надосадочную жидкость отфильтровать с помощью стерильного шприца, прикрепленного к мембранным фильтрам пор 0,2 мкм и мгновенно заморозить при температуре -80 °С<бр/> заметка: Используйте инсулиновый шприц (u-40) для аспирации фолликулярной жидкости.
5. Убедитесь, что для выделения КОК выбраны только здоровые фолликулы среднего размера (4-6 мм в диаметре).
   заметка: КОК I степени, обладающие интактным и круглым ооцитом с гомогенной ооплазмой и многослойными (не менее 3-4) компактными кумулюсами, считаются пригодными для дальнейшей процедуры 3D IVM.
6. Чтобы изолировать КОК, перенесите 2-3 яичника в стерильную чашку Петри диаметром 10 см, заполненную HM. Изолируйте КОК из фолликулов среднего размера, выполнив одну из приведенных ниже процедур.
   1. Аккуратно разрежьте поверхность выступающих фолликулов яичников стерильным хирургическим лезвием 15С. Это приведет к тому, что фолликулярная жидкость вместе с КОК будет вытекать в чашку Петри.
   2. Аспирируйте фолликулярное содержимое с помощью иглы 28 G размером 5/8", прикрепленной к одноразовому шприцу, и перенесите его в чашку Петри.
      заметка: Выбросьте остатки ткани яичников. Последующие этапы изоляции проводятся под стереомикроскопом.
7. Приготовьте 3–5 60 мм чашек Петри для ЭКО.
   1. Добавьте 1 мл HM в центральные лунки и поместите 3-4 капли HM (50 μL на каплю) в их наружные кольца.
   2. Затем с помощью поликарбонатной микропипетки переместите неповрежденные КОК к каплям НМ в наружные кольца, чтобы кратковременно промыть их 3-4 раза.
   3. В конце по отдельности переложите их в центральную лунку. Храните эти планшеты для ЭКО в инкубаторе для дальнейших процедур.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Общее
Антибиотик антимикотический (100x) 100мл	Термо Фишер	15240062	2,5% конечная концентрация для рабочей среды. 1% в PBS (шаг 1.2)
DMEM/F12 (500 мл)	Сигма-Олдрич	Д8062	Погрузочно-разгрузочная среда
FCS (100 мл)	Термо Фишер	16140063	Конечная концентрация 10% для рабочей среды. (шаг: 1.5)
PBS (1x, pH 7.4) 500мл	Термо Фишер	10010023
Среда созревания
ХГЧ (1 флакон из 10 000 ЕД)	Сигма-Олдрич	CG10
ПМСГ	БиоВендор	RP1782721000
Специфические приборы, инструменты
Чашка Pteri 30 мм	ТЭС	93040
Чашка Петри для ЭКО 60 мм	сокол	353653
инкубатор	Панасоник	МСО-170АИК-ПЭ	Можно использовать и другие бренды
Стерильная чашка Петри (10 см)	НЕСТ Биотехнология	704002
термос	кечуа	5602589	Можно использовать и другие бренды