$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Инкапсуляция в супергидрофобных фторированных этилен-пропиленовых микробиореакторах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все процедуры созревания in vitro (IVM) проводятся на термостатическом столе, а комплексы кумулюс-ооциты (COC) поддерживаются при температуре 38 °C на протяжении всей обработки.
- Приготовьте чашку Петри диаметром 30 мм, содержащую 5 г порошка FEP со средним размером частиц 1 мкм<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать свежий порошок FEP. Повторно используемый FEP имеет тенденцию агрегироваться и образовывать комки.
- Распределите одну каплю среды для созревания (MM) (объемом ~30 μL), содержащей 3-5 COC, на слой порошка FEP. Вращайте пластину осторожно круговыми движениями, чтобы убедиться, что эти частицы полностью покрыли поверхность жидкости каплей и образовались жидкие шарики (LM).
- Соберите сформированный LM с помощью пипетки с наконечником объемом 1 000 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте наконечник пипетки по краю, чтобы он соответствовал диаметру LM (4-5 мм). Примерный диаметр такого подготовленного наконечника должен быть немного больше, чем у ЛМ.
- Приготовьте несколько 60 мм экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в чашках Петри. Добавьте 3-4 мл стерильной воды в наружные кольца для подготовки камеры влажности. Затем поместите один LM в центральный колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует хороших мануальных навыков и аккуратности - если шарик будет размещен небрежно или упадет даже с небольшой высоты, он будет разрушен.
- Инкубируйте шарики в течение 4 дней при температуре 38 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
- Ежедневно меняйте среду после процедуры: наносите 30 мкл MM на каждую LM, что приведет к их растеканию, поскольку прямой контакт с жидкостью нарушает гидрофобность покрытых порошков FEP. Когда содержимое мрамора растворится, перенесите выделяющиеся из биореактора КОК в каплю свежего ММ в чашке Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного переноса высвобождающихся КОК используйте поликарбонатную микропипетку.
- После нескольких промывок в ММ (3-4 раза) для удаления частиц FEP перенесите их с 30 мкл свежего ММ на порошковый слой FEP. Аккуратно вращайте пластину круговыми движениями, чтобы частицы порошка полностью покрыли поверхность капли жидкости и образовали новую LM.
- Набирайте сформированный LM с помощью пипетки с наконечником объемом 1 000 мкл.
- Добавьте 3-4 мл стерильной воды в наружные кольца для подготовки камеры влажности. Затем поместите одну LM в центральную лунку чашки Петри для ЭКО.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачное покрытие порошка FEP позволяет контролировать содержание LM с помощью светового микроскопа.