Лазерная селективная абляция эндотелиальных клеток роговицы свиней: метод индуцирования фокусированного повреждения эндотелия роговицы свиньи для исследований ex vivo

Аннотация

Источник: Holzhey, A. et al., Разработка неинвазивной, лазерной экспериментальной модели потери эндотелиальных клеток роговицы. J. vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует неинвазивную лазерную процедуру для избирательного повреждения эндотелиальных клеток роговицы в свином глазу. Разработанная ex vivo модель повреждения эндотелиальных клеток может быть использована для изучения заболеваний эндотелия роговицы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка культуры органов и лазерное лечение

1. Получите свежеэнуклеированные свиные глаза на местной скотобойне. Храните их в прохладе (4 °C) в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной L-глутамином, пируватом натрия, пенициллином/стрептомицином (1%) и свиной сывороткой (10%), далее именуемой в этой статье полной средой.
2. Удалите внеклеточные ткани ножницами и замочите глаза в 5% офтальмологическом растворе повидон-йода на 5 минут, прежде чем поместить их в стерилизованный фосфатно-солевой буфер (PBS) до использования.
3. Скрининг глаз на наличие основных патологий переднего сегмента, таких как рубцевание роговицы, отек и другие помутнения с помощью аппарата оптической когерентной томографии в спектральной области (Таблица материалов).
4. Расположите глаза перед блоком щелевой лампы, оснащенным лазером Nd:YAG (Table of Materials), который имеет длину волны 1064 нм и диаметр фокусного пятна 10 мкм на воздухе.
   заметка: Для оптимального позиционирования используется напечатанный на 3D-принтере удерживающий аппарат, который был разработан для того, чтобы удерживать глаз прочно, не оказывая на него слишком большого давления (Рисунок 1).
5. Используйте увеличение в 12 раз и отклоните освещение, чтобы визуализировать отдельные слои роговицы.
6. Установите энергию импульса (например, 1,6 мДж) и точку фокусировки (например, 0,16 мм) для селективной абляции эндотелиальных клеток.
7. Поместите прозрачный парацентез роговицы рядом с лимбом и введите вязкоэластик (Таблица материалов) для стабилизации передней камеры.
8. Иссекайте центральную роговицу, обработанную лазером, с помощью трепана 8 мм.
9. Поместите иссеченную роговицу в лунку 12-луночного планшета эндотелиальным участком вверх и инкубируйте образец в 3 мл полной среды при 37 °C в течение 3 дней><. заметка: На этом этапе в среду могут быть добавлены потенциальные цитопротекторные агенты.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная установка.(А) Глаза были зафиксированы в частично напечатанном на 3D-принтере удерживающем устройстве, которое позволило точно выровнять лазерный луч. (B) Перед лазерным лечением ткань была оценена с помощью устройства оптической когерентной томографии переднего сегмента для проверки основных патологий переднего сегмента. Положения фокусн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вакуумный трепан Бэррона	Катена	К20-2058
криостат	Лейка	СМ 3050С
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - с высоким содержанием глюкозы	ПАА	Е-15009
Держатель для глаз	сам	Н/Д
Инвертированный микроскоп	Лейка	DMI 6000 B
КХ2ПО4	Мерк	529568
На2НПО4	Мерк	1065860500
Nd:YAG лазер	Цейсс Медитек	visuLAS YAG II plus
ОКТ Тканевые Тек	Сакура Тонкотехничная	4583
Пенициллин-стрептомицин	Сигма-Олдрич	П4333
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco	10010056
Свиная сыворотка	Сигма-Олдрич	12736С
Оптический когерентный томограф в спектральной области	Гейдельберг Инжиниринг	Спектралис
Планшет для культивирования тканей 12-луночный	Сарштедт	833921
Вязкоупругого	ОмниВижн	Метоцел