Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные и жилье
- Приобретайте кроликов новозеландской белой (NZW) весом 2-3 кг.
- Содержать кроликов поодиночке в клетках со строгим контролем температуры (65 ± 5 °F) и влажности (45 ± 5%). Освещение должно иметь 12-часовой цикл включения/выключения.
- Предоставьте неограниченный доступ к воде и стандартному кроличьему чау. Исключите диетические продукты, так как они могут содержать витамин А, который влияет на глаза.
- Акклиматизируйте животных не менее чем за 2 недели до исходных измерений или индукции сухого глаза.
2. Методы анестезии и эвтаназии
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры требуют умеренной седации, за исключением инъекции Con A, которая требует умеренной седации.
- Для легкого седативного эффекта введите ацепромазин (1 мг/кг) подкожно через плечи с помощью иглы 26-го калибра. Конечная точка для легкого седативного эффекта: животные сохраняют расслабленное положение головы с мочками ушей, которые больше не полностью вертикально стоят.
заметка: Если соответствующая конечная точка не достигнута, может быть введена дополнительная инъекция ацепромазина. Животные должны всегда оставаться бодрыми, отзывчивыми на прикосновения к своим усам, и никогда не должны проявлять замедленное дыхание.
- Для умеренного седативного эффекта сначала дайте животным ацепромазин, как указано выше. После достижения конечной точки (см. примечание выше) введите изофлуран с помощью противогаза с потокомО2, установленным на уровне 1 л/мин, и доставкой изофлурана, установленным на 5% (рис. 1).
- Вводите изофлуран до тех пор, пока тонус тела кролика полностью не расслабится, а уши полностью не станут висячими.
заметка: Не должно происходить компенсаторных движений мышц при повороте животного на бок; Дыхание всегда остается спонтанным.
- Спонтанное выздоровление происходит в течение 2-5 минут: признаки включают спонтанные движения головой и повышенный или нормальный мышечный тонус. После завершения экспериментальной процедуры с умеренным седативным препаратом наблюдайте за кроликами в течение примерно 30 мин или до тех пор, пока их поведение не нормализуется><.
заметка: Офтальмологическая мазь не требуется ни при одной из форм седации. 1) При легком седативном эффекте животные все еще бдительны и сохраняют рефлекс моргания. При умеренной седации торможение мигательного рефлекса настолько короткое, что поверхность глаза не подвергается риску. 2) Размещение офтальмологической мази на поверхности глаза исключает визуализацию структур, оцениваемых в ходе тестирования.
- Эвтаназия: Используйте передозировку внутривенного пентобарбитала (100 мг/кг).
3. Индукция и лечение сухого глаза
ПРИМЕЧАНИЕ: Вводятся три части системы орбитальных слезных желез.
- Успокоите кроликов ацепромазином в дозе 0,2 мг/кг подкожно.
- Состробите шерсть в области периорбити и кожи головы и полностью удалите остатки шерсти с помощью Nair. Оставьте кожу полностью гладкой для лучшей визуализации анатомических признаков и введите конканавалин А под контролем УЗИ (Рисунок 2).
- Вызывайте умеренный седативный эффект, как описано выше.
- Инъекция в пальпебральный отдел верхней слезной железы (PSLG)
заметка: Сначала выполните инъекцию PSLG.
- Нанесите на соответствующий глаз 25 μл лидокаина без консервантов 1% с помощью микропипетки.
- Отогните верхнее веко и мягко надавите медиальным путем на задний ободок орбиты, пока не будет виден выступ, отмечающий пальпебральную часть железы. PSLG проявляется в виде небольшого выпуклого возвышения в задней (височной) части верхнего века.
заметка: Чтобы рассмотреть ткань железы во время процесса обучения, нанесите на эту область 5% флуоресцеин (рис. 3А). Можно увидеть, как слезы струятся из луковичной PSLG. Применение флуоресцеина не требуется для введения Кон А; Это делается только в иллюстративных целях, чтобы показать ткань железы.
- С помощью щипцов с тонкими зубьями и иглы 27 калибра на туберкулиновом шприце проникнуть непосредственно в железу с помощью трансконъюнктивального доступа. Продвинуть иглу на 2 мм внутрь ткани и ввести 500 мкг Con A в объеме 0,1 мл (рис. 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция иногда может быть болезненной. При необходимости держать животных под действием изофлурана до тех пор, пока эта инъекция не будет завершена.
