Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение эндотелиальных клеток аорты свиньи
- В асептических условиях извлеките аорту свиньи из буфера для промывки и поместите ее на чашку Петри диаметром 150 мм (рис. 1A).
- Аккуратно отрежьте два конца аорты и снова иссеките излишки ткани вокруг аорты стерильными щипцами и ножницами (рисунок 1B). Промойте наружную и внутреннюю часть аорты (над чашкой для культивирования при комнатной температуре) 20−50 мл промывочного буфера: 1x раствор PBS (pH 7,4) с 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин.
заметка: Старайтесь вырезать только ту область, где были установлены зажимы во время операции, так как некоторые ЭК были повреждены в этой области, и удалите лишние ткани и боковые ветви артерий.
- Проведите хирургический шов через аорту, а затем перевяжите один конец аорты с помощью хирургического шва (5-0, 90 см, Таблица материалов). Держите хирургический шов внутри аорты (рис. 1C, D).
- Аккуратно зафиксируйте аорту возле перевязанного конца щипцами, а затем медленно потяните хирургический шов, чтобы перевернуть аорту до тех пор, пока эндотелиальная поверхность аорты не обнажится (рисунок 1E−G).
заметка: Убедитесь, что аорта зафиксирована рядом с перевязанным концом, и не фиксируйте аорту туго, иначе аорту невозможно перевернуть, натянув хирургический шов.
- Промойте эндотелиальную поверхность аорты промывочным буфером 3x (10 мл на промывку), а затем выбросьте этот раствор. Поместите аорту в центрифужную пробирку объемом 15 мл и залейте аорту 10 мл 0,005% коллагеназы внутривенно в пробирке (рис. 1H).
заметка: Предварительно подогрейте 0,005% коллагеназу в/в пищеварительном растворе при температуре 37 °C перед перевариванием.
- Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Поместить переваренную аорту и пищеварительный раствор в чашку для культивирования диаметром 100 мм и остановить действие 0,005% коллагеназы внутривенно, добавив 10−15 мл предварительно охлажденного останавливающего буфера: модифицированную среду Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% инактивированной при нагревании FBS и 1% P/S.
заметка: Рекомендуемое время переваривания составляет от 10 до 20 минут. Убедитесь, что эндотелиальная поверхность аорты покрыта стопорным буфером.
- Аккуратно соскребите pAEC с внутренней поверхности аорты с помощью скребка для клеток (рисунок 1I). Промойте соскобленную аорту 3 раза с помощью промывочного буфера (5 мл за раз). Налейте раствор из чашки для культивирования в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Промойте дно чашки для культивирования 2 раза с помощью промывочного буфера (5 мл за раз) и снова налейте раствор в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
заметка: Соскребите в одном направлении аккуратно и не сжимайте. Не прикасайтесь к ткани рядом с краями и отверстиями. Рекомендуется выскабливать 5−8 раз.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 600 x g в течение 6 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте 10 мл раствора на дне центрифужной пробирки объемом 50 мл. Добавьте 20 мл промывочного буфера в центрифужную пробирку объемом 50 мл и повторно суспендируйте гранулы. Избегайте образования пузырей на этом этапе.
- Центрифугируйте при 600 x g в течение 6 мин при 4 °C. Медленно выбросьте надосадочную жидкость. Суспендируйте клеточные гранулы с 1 мл питательной среды и хорошо перемешайте.<бр/>
заметка: Полученное среднее число ЭК на см аорты составляет 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (среднее значение ± SD, n = 3).
- Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек. Планшет и культивирование клеток в сосуде без покрытия какими-либо материалами в соответствии с номером клетки. Если число клеток меньше или равно 1,0 x 10⁶, культивируйте клетки в колбе размером 25 см². Если число клеток больше 1,0 x 10⁶, культивируйте клетки в нескольких колбах размером 25 см² (1,0 x 10⁶ клеток в колбе). Поместите колбу в инкубатор (не встряхивая) при температуре 37 °C с 5% CO₂ и заменяйте среду каждые 2−3 дня.
заметка: Некоторые клетки повреждаются скребком для клеток. Анализ жизнеспособности клеток показал, что процент живых клеток составляет 95,7% ± 1,7% (среднее значение ± SD, n = 3). Время удвоения выделенных клеток составляет около 1−2 суток.
