$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Изоляция коротких задних цилиарных артерий
Глаза свиньи вместе со зрительным нервом и экстраокулярными тканями были получены сразу после смерти. Энуклеированные глаза транспортировали в лабораторию в ледяном фосфатно-солевом буфере (PBS) и немедленно использовали.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свиной глаз в основном делится на переднюю (Рисунок 1A) и заднюю части (Рисунок 1B).
- Поместите глазной шар в камеру для препарирования, содержащую ледяной буфер Кребса-Хенселеита (K-H). Аккуратно отрежьте окружающие мышцы и ткани острыми ножницами Майо.
заметка: Для приготовления буфера Krebs-Henseleit (K-H) взвесьте следующие химические вещества (27,68 г NaCl, 8,4 г NaHCO 3,1,4 г KCl, 1,18 г MgSO4 и 0,64 г KH2PO4) в одну сухую и чистую коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и 1,47 г CaCl2 и 8,0 г глюкозы в другую пробирку. Порошковую смесь этих химикатов следует хранить в прохладном и сухом месте. Смесь CaCl2 и порошка глюкозы лучше всего готовить в свежем виде, чтобы предотвратить впитывание влаги и образование комков.
- Сделайте надрез скальпелем и разрежьте глобус по экваториальной плоскости острыми ножницами Майо до тех пор, пока глаз не разделится на переднюю и заднюю половины. Удалите как можно больше стекловидного тела из задней половины глаза с помощью пары щипцов стандартного образца.
заметка: Разделение глазного яблока на две половины облегчает изоляцию коротких задних цилиарных артерий (sPCA) без необходимости перемещения глаза в диссекционной чашке. Однако этот шаг не является обязательным. Сосуды также могут быть изолированы, не открывая глазной шар.
- С помощью диссекционных штифтов аккуратно прижмите заднюю половину глаза сетчаткой вниз и зрительным нервом вверх к экспериментатору.
- Аккуратно разрежьте соединительные ткани, окружающие зрительный нерв, чтобы обнажить нижележащую ретробульбарную сосудистую сеть с помощью пружинных ножниц Student Vannas.
- sPCA можно рассматривать в виде коротких ветвей сосудов (между 5-8 ветвями), которые проникают в склеру и по окружности окружают диск зрительного нерва (рис. 1C). Изолируйте параоптический и дистальный sPCA вместе с окружающими соединительными тканями с помощью пары прецизионных пинцетов типа 5 и капсулотомических ножниц Vannas (рис. 1D).
заметка: Убедитесь, что буфер K-H остается ледяным на протяжении всей процедуры изоляции. Настоятельно рекомендуется менять буфер каждые 20-30 минут, в зависимости от температуры окружающей среды.
2. Подготовка образцов
- Аккуратно удалите соединительные ткани из артериальных сегментов с помощью прецизионного пинцета типа 5 с очень тонкими наконечниками и капсулотомических ножниц Vannas под стереомикроскопом и промойте изолированные артерии ледяным PBS для удаления загрязнений и остатков крови.
заметка: Если образцы не были подвергнуты следующим действиям немедленно, заморозьте их в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
