Витрификация эмбрионов кроликов с использованием криогенной соломы: метод сверхбыстрого охлаждения для сохранения эмбрионов кроликов для долгосрочного хранения

Аннотация

Источник: Гарсия-Домингес, X. et al. Минимально инвазивный перенос эмбрионов и витрификация эмбрионов на оптимальной стадии эмбриона в модели кролика. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы описываем процедуру витрификации собранных эмбрионов кроликов на желаемой стадии развития с использованием этиленгликоля и диметилсульфоксида в качестве криопротекторов и криогенной соломы в качестве несущей системы. Витрифицированные эмбрионы имеют высокую выживаемость и могут храниться в течение длительного периода времени до использования.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Витрификация эмбриона

1. Все манипуляции выполняют при комнатной температуре (около 22 °C), чтобы снизить токсичность раствора остекловывания при более высоких температурах.
   заметка: В этом протоколе эмбрионы можно перемещать с помощью автоматической пипетки объемом 0,1–2 мкл, но могут подойти и другие подобные устройства для перемещения эмбрионов, перетаскивая минимальный объем.
2. Витрификация эмбрионов проводится в два этапа по процедуре добавления:
   1. Поместите эмбрионы на 2 минуты в уравновешивающий раствор, состоящий из 10% (v/v) этиленгликоля и 10% (v/v) диметилсульфоксида, растворенного в основной среде (BM). (Состав BM: фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) с добавлением 0,2% (w/v) бычьего сывороточного альбумина)
   2. Переместите эмбрионы (начиная с шага 1.2.1) на 1 минуту в раствор для витрификации, состоящий из 20% (v/v) этиленгликоля и 20% (v/v) диметилсульфоксида, растворенного в BM.
3. Загрузите эмбрионы в пластиковую мини-трубочку объемом 0,25 мл (которая содержит один закрытый конец с ватной пробкой и один открытый край). Этот процесс схематизирован на рисунке 1.
   1. Соедините закрытый конец министроуза объемом 0,25 мл с подходящим микродозатором (например, Captroll III).®
   2. Отсасывайте БМ до 1/3 длины соломинки, следом за ним небольшой пузырь воздуха.
   3. Аспирируйте эмбрионы в объеме 40 мкл раствора для витрификации, после чего добавьте еще один небольшой пузырь воздуха.
   4. Отсасывайте БМ до тех пор, пока первая жидкая фракция (шаг 1.3.2) не достигнет ваты.
   5. Закройте открытый конец соломинкой-заглушкой.
4. Выполняйте шаг 1.2.2 во время выполнения шага 1.3, чтобы гарантировать, что пройдет не более одной минуты, что может быть токсичным для эмбрионов.
5. Погрузите министрогу непосредственно в жидкий азот для достижения остеклования.
6. Храните мини-соломинку в дьюаре для азота в течение нужного времени.

Результаты

Рисунок 1: Схематизация правильно загруженной соломы. А) БМ относится к средам, манипулирующим эмбрионом, используемым во время витрификации. Эмбрионы должны быть загружены в раствор для витрификации. Б) Макроскопический вид загруженной соломинки с увеличенной детализацией положения эмбриона. Это устройство большого объема позволяет нам витрифицировать большое количество эмбрионов, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	ВВР	332
Диметилсульфоксид	Сигма Олдрич	W387509
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Сигма Олдрич	Д5773	Без хлорида кальция.
Этиленгликоль	Сигма Олдрич	102466-М
Жидкий азот	Эр Ликид	P1505XXX
Пластиковая соломинка 0,25 мл	IMV - технологии	Номер 6431
Стереомикроскоп	Лейка	MZ16F	Есть более дешевые варианты, такие как Leica MZ8 или Nikon SMZ-10 или SMZ-2B, и это лишь некоторые из них.
Заглушка для соломинки	IMV - технологии	Номер 6431