Загрузка гранул для введения нуклеиновых кислот в адгезивные культивируемые клетки: метод загрузки флуоресцентных белков-кодирующих плазмид в адгезивные клетки млекопитающих

Аннотация

Источник: Cialek, C. A. et al. шарики загружают белки и нуклеиновые кислоты в адгезивные клетки человека. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы описываем процедуру введения нуклеиновых кислот в адгезивные клетки млекопитающих с помощью загрузки шариков.

Протокол

1. Ячейки загрузки борта

ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости кратковременно промойте клетки фосфатно-соевым буфером (PBS), а затем добавьте 2 мл оптимальной среды. Инкубируйте не менее 30 минут.

1. Приготовьте раствор объемом 3-8 μл, содержащий желаемые плазмиды, белок и/или частицы. Используйте ~1 μг (0,1-1 пмоль) каждого типа плазмиды и ~0,5 μг (0,01 нмоль) белка, в зависимости от экспериментальных требований. Используйте пробирку с низким удержанием белков, чтобы они не оставались на стенках пробирки. Доведите концентрацию раствора до минимума до 3 мкл с помощью PBS и отрегулируйте объем раствора таким образом, чтобы покрыть всю площадь загружаемых ячеек (т.е. микролунку камеры, рис. 1B).
2. Тщательно перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз и/или щелкая по трубке. Кратковременно опустите раствор на дно пробирки в настольной микрофуге.
3. Перенесите раствор для загрузки шариков и камеру с клетками в колпак для культуры тканей. Выполните остальные этапы в капюшоне для культуры тканей стерильной техникой.
4. Извлеките среду из клеток и временно храните ее в стерильной пробирке. Осторожно отсасывайте всю среду со всех краев камеры, наклоните камеру примерно под углом 45° и удалите остатки капли среды из центральной микролунки. Во время удаления среды следите за тем, чтобы наконечник пипетки не касался стекла, что может привести к отслаиванию и потере клеток. Быстро переходите к следующему шагу, чтобы клетки не сохли долго.
5. Аккуратно нанесите раствор для загрузки шариков на стеклянную микролунку в центре камеры. Дополнительно: Инкубируйте с легким покачиванием в течение ~30 с, не допуская полного высыхания камеры.
6. Аккуратно диспергируйте монослой стеклянных шариков поверх ячеек, желательно с помощью устройства для загрузки шариков (рис. 1А). Следите за тем, чтобы шарики полностью покрывали ячейки в микролунке со стеклянным дном.
7. Зажав патронник двумя пальцами, постучите его по поверхности капота, подняв его на ~2 дюйма и сильно опустив вниз. Примените силу, примерно эквивалентную падению тарелки с этой высоты. Повторите в общей сложности ~10 нажатий.
   заметка: Следите за тем, чтобы краны существенно не отслаивали ячейки. Нарезание резьбы может быть оптимизировано для типа ячейки. Если ячейки загружаются плохо, нажмите сильнее; Однако, если многие ячейки отслаиваются, слегка постучите.
8. Аккуратно добавьте среду обратно в камеру, медленно нанося пипетирование на пластиковую сторону камеры. Постарайтесь аспирировать любые плавающие шарики, не потревожив клетки. На этом этапе добавьте больше предварительно подогретого материала, если было удалено слишком много. Инкубируйте клетки в течение 0,5-2 ч в инкубаторе.

Результаты

Иллюстрация 1: Устройство для загрузки борта, техника и сроки

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки для клеточных культур 10 см	ВВР	82050-916	Использование для культивирования клеток
Чашки для клеточных культур 35 мм	сокол	353001	Использование для создания загрузчика валиков
Камера с ячейками Attofluor	Thermo Fisher Scientific	А7816	Используйте для создания пользовательского загрузчика валиков
DMEM, высокий уровень глюкозы, без глютамина	Thermo Fisher Scientific	11960069	Применение в общей клеточной культуре
Посуда со стеклянным дном, 35 мм, #1.5, 14 мм стекло	Корпорация MatTek	П35Г-1.5-14-С	Затравочные клетки помещаются в эти камеры для визуализации
Стеклянные шарики, промытые кислотой, ≤ 106 μм	Миллипора Сигма	Г4649	Посыпьте клетки для загрузки плазмидной ДНК и белков
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Thermo Fisher Scientific	АМ9625	Рабочий состав стерильный 1X PBS
DMEM, не содержащий фенола	Thermo Fisher Scientific	31053036	Использование на клетках перед визуализацией
Opti-MEM, Средство для пониженного содержания сыворотки	Thermo Fisher Scientific	31985070	Оптимальная среда для инкубации клеток перед загрузкой гранул (необязательный этап)