Доставка нуклеиновых кислот с помощью нанолезвий: метод доставки комплекса Cas9-sgRNA к клеткам-мишеням с помощью вирусоподобных частиц

Аннотация

Источник: Mangeot, P. E., et al. Доставка комплекса рибонуклеопротеинов Cas9/sgRNA в иммортализированные и первичные клетки с помощью вирусоподобных частиц ("нанолезвий"). J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует технику доставки комплекса рибонуклеопротеинов Cas9-sgRNA внутри клеток-мишеней с помощью нанолезвий для редактирования генома. Нанолезвия представляют собой вирусоподобные частицы, лишенные способности размножаться и заражать соседние клетки, поэтому очень полезны для быстрой и дозозависимой транспортировки био- и наноматериалов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Дизайн и клонирование sgRNA

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации по дизайну sgРНК могут быть получены из нескольких источников, таких как https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing или от Hanna and Doench.

1. После того, как 20 нуклеотидных последовательностей sgРНК сконструированы, упорядочьте следующие одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды:
   1. Вперед: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N соответствует целевому локусу без последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM))
   2. Реверс: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N соответствует обратному комплементу целевого локуса без последовательности PAM)
      заметка: При заказе олигонуклеотидов не требуется никаких специальных модификаций (нет необходимости в 5'-фосфате).
2. Гибридизовать два олигонуклеотида ДНК в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 0,2 мл путем смешивания 5 мкл буфера для отжига (500 мМ NaCl; 100 мМ Tris-HCl; 100 мМ MgCl2; 10 мМ DTT; pH 7,9 при 25 °C), 1 мкл каждого олигонуклеотида ДНК (100 мкМ стокового раствора в воде) и 42 мкл воды.
3. На блоке ПЦР инкубировать образцы при температуре 95 °C в течение 15 с, а затем снизить температуру до 20 °C с нарастанием 0,5 °C/с. Хранить при комнатной температуре или хранить при температуре -20 °C.
   заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
4. Расщеплять 10 мкг экспрессии sgRNA плазмид BLADE или SUPERBLADE с 10 единицами фермента рестрикции BsmBI-v2 в течение 3 ч при 55 °C в общем реакционном объеме 50 мкл.
   заметка: Расщепленный вектор должен высвободить вставку ДНК размером ~1,9.н. и второй фрагмент ДНК размером ~3.3.н.
5. Нагрузите рестрикционную реакцию на 1% агарозный гель, окрашенный 5 мкг/мл бромида этидия (или более безопасным альтернативным гелевым окрашиванием ДНК).
   заметка: Надевайте соответствующее защитное снаряжение при работе с бромидом этидия, который подозревается в причинении генетических дефектов.
   1. На ультрафиолетовом (УФ) столе, установленном на длине волны 312 нм (чтобы не повредить ДНК), вырежьте фрагмент ДНК размером 3,3 кб из геля и поместите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл><. ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте соответствующее защитное снаряжение (перчатки и очки для защиты от ультрафиолета) при работе с бромидом этидия и работе на столе для ультрафиолета.
   2. Извлеките ДНК из среза геля, содержащего фрагмент ДНК размером 3,3 кб, с помощью специального набора для экстракции геля ДНК (см. Таблицу материалов). Количественное определение количества очищенной ДНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
6. Лигируйте гибридизованные прямые и обратные олигонуклеотиды ДНК с этапа 1.2 до вектора BLADES или SUPERBLADE, расщепленного BsmB1, очищенного от геля, с этапа 1.5.2. Для этого добавляют 2 мкл буфера ДНК-лигазы Т4, 50 нг очищенного гелем вектора (с шага 1.5.2), 1 μл гибридизованных олигонуклеотидов ДНК (с шага 1.2), воду для заполнения объема до 19 μл и 1 μл ДНК-лигазы Т4. Инкубировать реакцию при 25 °C в течение 10 минут.
   1. Превратите продукт лигирования в компетентные бактерии (см. Таблицу материалов). Поместите преобразованные бактерии на агаровую пластину с ампициллином Лурия Бертани и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C.
   2. Выберите несколько изолированных колоний на агаровой пластине для проведения мини-подготовки ДНК (см. Таблицу материалов) и выполните секвенирование по Сэнгеру с использованием прямого праймера U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') для проверки правильности лигирования вариабельной последовательности sgRNA.
      Примечание: Можно использовать другие плазмиды экспрессии sgРНК, если они не кодируют белок Cas9, который может мешать производству Nanoblade.

2. Плазмидный препарат

1. Проведите максиподготовку (см. Таблицу материалов) всех необходимых плазмид и приготовьте 10 мкг аликвот в концентрации 1 мкг/мл для хранения при -20 °C. Избегайте повторных циклов замораживания/размораживания плазмид, используйте аликвоты дважды перед тем, как отбросить их.

3. Подготовка нанолезвия

1. В 1-й день засейте от 3,5 до 4 × 10-6 HEK293T клеток (см. Таблицу материалов) в 10 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle (DMEM), содержащей высокое содержание глюкозы, пирувата натрия, L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин/стрептомицин в 10-сантиметровой чашке для клеточной культуры. Осторожно переместите 10-сантиметровую пластину вперед и назад, затем справа налево (повторите эту последовательность 5 раз), чтобы равномерно распределить клетки по чашке для культивирования. Инкубируйте клетки при 37 °C в клеточном инкубаторе с 5% CO₂,
   заметка: Все процедуры, связанные с обращением с культивируемыми клетками и нанолезвиями, должны выполняться под ламинарным проточным колпаком для клеточных культур, чтобы избежать их контаминации.
2. День 2: Трансфекция плазмид
   1. Клетки должны быть слиты на 70-80% через 24 ч после нанесения покрытия (Рисунок 1А). Замените среду 10 мл свежего DMEM, содержащего высокое содержание глюкозы, пирувата натрия, L-глутамина, 10% FBS (пенициллин и стрептомицин можно не добавлять, хотя это не обязательно) перед трансфекцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно, чтобы клетки не сливались друг с другом. В противном случае эффективность трансфекции, а также производство частиц могут быть снижены.
   2. Для каждой 10-сантиметровой пластины приготовьте следующее количество плазмид в пробирке объемом 1,5 мл: 0,3 мкг pCMV-VSV-G, 0,7 мкг pBaEVRless, 2,7 мкг MLV Gag/Pol, 1,7 мкг BIC-Gag-Cas9, 4,4 мкг плазмиды BLADES или SUPERBLADES, кодирующей клонированную sgRNA (или 2,2 мкг каждая, если использовать две sgRNA).
   3. Добавьте 500 μL трансфекционного буфера (см. Таблицу материалов), сделайте вихрь в течение 10 с, а затем центрифугируйте в течение 1 с. Добавьте 20 μЛ реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов), сделайте вихревой пробирку в течение 1 с, а затем центрифугируйте в течение 1 с.
   4. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре и добавить весь раствор по каплям в клетки среды DMEM с помощью пипеттора P1000. Осторожно перемещайте пластину 10 см вперед и назад, затем справа налево (повторите эту последовательность 5 раз), чтобы равномерно распределить реагент для трансфекции по клеткам. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение не менее 40 ч в клеточном инкубаторе с 5% CO₂,
      заметка: При желании среду можно сменить через 4 ч после трансфекции.
3. На 3-й день проверьте морфологию трансфицированных клеток под микроскопом.
   заметка: Клетки-продуценты начнут сливаться. Это нормальное явление из-за экспрессии фузогенных вирусных оболочек (рис. 1B, C).
4. День 4: Сбор урожая Nanoblades
   заметка: По крайней мере, через 40 ч после трансфекции клетки сливаются вместе из-за экспрессии фузогенных вирусных оболочек, а иногда клетки полностью отделяются от опоры пластины (рис. 1D).
   1. Соберите 9 мл надосадочной жидкости культуральной среды с помощью пипетки объемом 10 мл.
      заметка: Нанолезвия представляют собой VLP, способные доставлять белок Cas9 и связанную с ним sgRNA в первичные клетки и in vivo. Хотя они не считаются генетически модифицированными организмами, поскольку лишены генетического материала, они могут вызывать генетические изменения. Поэтому с ними следует манипулировать с осторожностью, чтобы избежать любого контакта с пользователями (особенно если они запрограммированы на нацеливание на гены-супрессоры опухолей). Пользователям рекомендуется следовать местным рекомендациям по технике безопасности при манипулировании ретровирусными векторами и работать в лаборатории уровня BSL-2 при подготовке VLP и проведении экспериментов по трансдукции. Нанолезвия могут быть инактивированы 70% этанола или 0,5% гипохлорита натрия. Также рекомендуется обрабатывать все пластиковые отходы (наконечники для пипеток, планшеты для культивирования тканей, центрифугирующие пробирки) 0,5% гипохлорита натрия в течение не менее 10 минут для инактивации нанолезвий.
   2. Центрифугируйте собранную надосадочную жидкость при 500 × г в течение 5 минут, чтобы удалить клеточный мусор и восстановить надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нанолезвия предназначены для использования на первичных клетках, фильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм или 0,8 мкм. Имейте в виду, что этот шаг значительно снижает титр нанолезвия, так как значительная часть будет заблокирована в мембране фильтра.
   3. Гранулируйте нанолопасти в течение ночи (12-16 часов) в роторе с качающимся ковшом при 4 300 × г или при 209 490 × г в ультрацентрифуге в течение 75 минут при 4 °C (см. Таблицу материалов><). ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки-мишени могут расти в DMEM, их можно инкубировать непосредственно с надосадочной жидкостью, полученной после шага 3.4.2, без концентрации нанолезвий.
5. День 5: Ресуспендирование и хранение наноклинков
   1. После центрифугирования медленно отсасывайте среду и повторно суспендируйте белую гранулу 100 мкл холодного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Накройте пробирку парапленкой и выдерживайте в течение 1 ч при 4 °C при осторожном перемешивании, прежде чем снова суспендировать гранулу пипетированием вверх и вниз.
      заметка: При повторной суспензии может появиться белый вязкий материал; Это нормально и не оказывает существенного влияния на эффективность трансдукции.
   2. Храните нанолезвия при температуре 4 °C, если планируете использовать их, в течение четырех недель. В противном случае заморозьте нанолезвия в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте защитные очки и криогенные перчатки при работе с жидким азотом. Мгновенная заморозка и хранение при -80 °C приводит к значительному снижению эффективности Nanoblade. Более того, размороженные нанолезвия не должны быть заморожены повторно. Протокол можно поставить на паузу здесь.

4. Концентрация нанолезвий на подушке из сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы ночным центрифугированию или ультрацентрифугированию (шаг 3.4.3), нанолезвия могут быть сконцентрированы на подушке из сахарозы. Это дает более чистую фракцию наноклинков, хотя общее количество восстановленных будет ниже.

1. Приготовьте 10% раствор сахарозы (по весу к объему) в 1x PBS и отфильтруйте его через шприцевой фильтр 0,2 мкм (см. Таблицу материалов).
2. Начните процесс концентрации нанолезвий на подушке из сахарозы.
   1. Поместите 9 мл образца, содержащего VLP (из шага 3.4.3), в ультрацентрифужную пробирку (см. Таблицу материалов). С помощью шприца объемом 3 мл и канюли медленно нанесите 2,5 мл 10% сахарозы под образец, стараясь не смешивать образец, содержащий VLP, и раствор сахарозы.
   2. В качестве альтернативы поместите 2,5 мл 10% сахарозы в ультрацентрифужную пробирку (см. Таблицу материалов). Наклоните пробирку и медленно добавьте 9 мл образца, содержащего VLP (из шага 3.4.3) с помощью низкооборотного дозатора. Во время этой операции постепенно поднимайте трубку в вертикальное положение.
3. Центрифугируйте образцы при концентрации 209 490 × г в ультрацентрифуге в течение 90 мин при 4 °C.
   заметка: Этот метод может быть адаптирован для низкоскоростного центрифугирования (4 300 × г) в течение ночи.
4. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость и положите пробирку вверх дном на папиросную бумагу, чтобы удалить остатки жидкости. Через 1 минуту добавьте 100 μL 1x PBS и поместите пробирку при температуре 4 °C с крышкой из парапленки в держатель пробирки на стол для перемешивания на 1 ч (см. Таблицу материалов) перед тем, как снова суспендировать гранулу пипетированием вверх и вниз><. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.

5. Мониторинг загрузки Cas9 в Nanoblades с помощью dot-blot

1. Приготовьте буфер для разбавления, добавив 1 объем буфера для лизиса, содержащего неионогенное поверхностно-активное вещество (см. Таблицу материалов) в 4 объема по 1x PBS. Разбавьте 2 мкл концентрированных нанолезвий в 50 мкл буфера для разбавления, кратковременно перемешайте и переведите 25 мкл этой смеси в новую пробирку, содержащую 25 мкл буфера для разбавления. Повторите эту операцию, чтобы получить 4 пробирки с разведениями Nanoblade (2-кратное разбавление).
2. Для стандартного контроля разбавьте 2 мкл рекомбинантной нуклеазы Cas9 (см. Таблицу материалов) в 50 мкл буфера для разведения, кратко перемешайте и выполните восемь последовательных разведений (2-кратное разведение для каждой стадии).
3. Осторожно нанесите 2,5 мкл каждого разведения VLP и 2,5 мкл каждого стандарта на нитроцеллюлозную мембрану с многоканальной пипеткой (больший объем может привести к появлению перекрывающихся пятен).
   заметка: Также может быть использована мембрана из поливинилдифторида, обработанная метанолом.
4. После того, как частицы впитаются на мембрану, заблокируйте мембрану 1x Трис-буферным физиологическим раствором, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещество (TBS-T) с добавлением обезжиренного сухого молока (5% w/v) на 45 минут при комнатной температуре><. заметка: Здесь протокол может быть приостановлен, а мембрана сохранена при температуре 4 °C в 1x TBS-T.
5. Выбросьте 1x TBST с добавлением обезжиренного сухого молока и инкубируйте мембрану в течение ночи при 4 °C с антителом к пероксидазе Cas9-хрена (разведение 1/1000 в 1x TBST, 5% молока). Промойте мембрану 3 раза с помощью TBS-T и визуализируйте сигнал с помощью улучшенного набора хемилюминесцентной подложки.
6. Количественно оцените интенсивность точек для нанолезвий и стандартных разведений рекомбинантного Cas9 с помощью запатентованного программного обеспечения, поставляемого со станцией визуализации геля или imageJ. Определите линейную кривую, связывающую интенсивность точек с концентрацией Cas9. Используя функцию полученной кривой, экстраполировать содержание Cas9 в каждом препарате.
   заметка: Количество рекомбинантного белка контроля Cas9 может насытить показания для наиболее концентрированных образцов стандартного набора разведений (рис. 2). Поэтому при определении линейной кривой рекомендуется удалять показания неразбавленных образцов (а иногда и показания первых стадий разбавления), если они не находятся в линейном диапазоне по отношению к известной концентрации Cas9, которая была обнаружена. Аналогичным образом, при экстраполяции количества Cas9 в образцах Nanoblade используйте только те показания, которые находятся в пределах линейного диапазона стандартной кривой.

6. Трансдукция клеток-мишеней с помощью Nanoblades (процедура трансдукции в 12-луночный планшет)

1. В 12-луночный планшет засейте 100 000-200 000 клеток (либо первичных, либо иммортализированных адгезивных клеток) в лунку в 1 мл соответствующей среды для культивирования клеток. Перед трансдукцией дайте клеткам прилипнуть к поверхности пластины.
2. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 5-20 мкл концентрированных нанолезвий (начиная с шага 3.5.1 или 4.4) к 500 мкл среды для культивирования клеток и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипеттора P1000. Удалите среду из клеток и замените ее 500 μл этой смеси Nanoblade.
   заметка: Трансдукция должна быть оптимизирована для каждого типа клеток. Важно использовать как можно меньший объем среды (при этом избегая высыхания целевых клеток), чтобы нанолезвия оставались высококонцентрированными. Адгезивные клетки должны трансдуцироваться непосредственно во время прикрепления к пластине (не трансдуцируйте во взвешенном состоянии, так как это значительно снизит эффективность трансдукции). Некоторые клетки выдерживают длительное воздействие нанолезвий (24-48 часов), в то время как другие очень чувствительны и могут образовывать небольшие синцитии. В этом случае нанолезвия необходимо инкубировать с клетками только в течение 4-6 ч перед заменой среды. Спинокуляция также может улучшить трансдукцию клеток, выращенных в суспензии. Адъюванты, такие как катионные полимеры (см. Таблицу материалов), также могут повысить эффективность трансдукции в некоторых типах клеток.
3. После 4-6 ч инкубации клеток в небольшом объеме среды, содержащей нанолезвия, увеличьте объем среды до нормального количества (1 мл при работе с 12-луночным планшетом) или замените ее свежей средой, если клетки чувствительны к VLP><. заметка: Клеточную среду, содержащую нанолезвия, необходимо инактивировать 0,5% гипохлорита натрия в течение 10 минут перед тем, как отбросить ее. Используйте перчатки и защитные очки при работе с гипохлоритом натрия. Если нанолезвия вызывают гибель клеток, адаптируйте количество и общее время воздействия, чтобы снизить смертность клеток.

Результаты

Рисунок 1: Морфология клеток-продуцентов при производстве нанолезвий.(А) HEK293T клетки при 70-80% слиянии через 24 ч после осаждения. (В и В) HEK293T морфологии клеток через 24 ч после трансфекции. (D) HEK293T морфологию клеток через 40 ч после трансфекции. Масштабные линейки = 400 μм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
13,2 мл, Тонкостенные полипропиленовые трубки, 14 x 89 мм - 50 шт.	Beckman Coulter Медико-биологические науки	331372	Ультрацентрифужные пробирки для очистки нанолезвий
Блоттинговые мембраны Amersham Protran Premium Western, нитроцеллюлоза	Мерк	GE10600004	Нитроцеллюлозная мембрана для количественного определения уровня Cas9 в очищенных нанолезвиях
BIC-Gag-CAS9	Адджен	119942	Кодирует слияние GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Позволяет производить вирусоподобные частицы GAG-CAS9 из клеток-продуцентов в ассоциации с сверхэкспрессированными гРНК и соответствующими оболочками
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Адджен	120922	Кодирует слияние GAG-dCAS9-VPR для целевой активации транскрипции
лезвие	Адджен	134912	Пустая основа для клонирования последовательности sgRNA будет использоваться в системе Nanoblades
БСМБИ-в2	Биолаборатории Новой Англии	Р0739С	Фермент рестрикции для расщепления векторов BLADE и SUPERBLADES для клонирования sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Мышиный mAb (конъюгат HRP) #97982	Технология клеточной сигнализации	97982С	Антитела Anti-Cas9 для количественного определения Cas9 методом дот-блоттинга
Cas9 Nuclease, S. pyogenes	Биолаборатории Новой Англии	М0386Т	Рекомбинантный белок Cas9 будет использоваться в качестве эталона для абсолютного количественного определения количества Cas9, загруженного в нанолезвия
Раствор бромида этидия (10 мг/мл в H2O)	Сигма-Олдрич	Е1510-10МЛ	Для окрашивания агарозными гелями и визуализации ДНК
Вибростенды Fisherbrand Wave	Научный центр Фишера	88-861-028	Стол для перемешивания для ресуспендирования нанолезвий после центрифугирования
Анализатор gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; количественная оценка интенсивности полосы после пищеварения
Gesicle Producer 293T	Такара	632617	Клеточная линия производителя нанолезвий
Gibco DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват	ThermoFisher Scientific	41966052	Питательная среда для клеток Gesicle Producer 293T
Набор реагентов jetPRIME Transfection для ДНК и ДНК/миРНК	Полиплюс	POL114-15	Реагент для трансфекции для производства Nanoblade в клетках Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 мкм, шприцевой фильтр	Многородность	SLAA033SS	Шприцевой фильтр для удаления клеточного мусора перед концентрированием нанолезвий
Millex-GS, 0,22 мкм, шприцевой фильтр	Многородность	SLGS033SS	Шприц-фильтр для стерилизации раствором подушки сахарозы
Millex-HP, 0,45 мкм, полиэфирсульфон, шприцевой фильтр	Многородность	SLHP033RS	Шприцевой фильтр для удаления клеточного мусора перед концентрацией Nanoblades
Набор для экстракции геля ДНК Monarch	Биолаборатории Новой Англии	Т1020Л	Набор для экстракции геля ДНК для очистки фрагмента плазмиды pBLADES или pSUPERBLADES при расщеплении с помощью BsmBI
NEB Стабильная компетентная кишечная палочка (высокая эффективность)	Биолаборатории Новой Англии	С3040И	Компетентные бактерии для трансформации и амплификации плазмид
Набор NucleoBond Xtra Midi для трансфекционной плазмидной ДНК	Мачери-Нагель	740410.5	Набор для приготовления максипрепаратов для очистки плазмидной ДНК от культивируемых бактерий
Набор для экстракции нуклеоспиновой гДНК	Мачери-Нагель	740952.5	Экстракция геномной ДНК из трансдуцированных клеток
NucleoSpin Plasmid, Мини-набор для плазмидной ДНК	Мачери-Нагель	740588.5	Мини-набор для очистки плазмидной ДНК от культивируемых бактерий
NucleoSpin Tissue, Мини-набор для анализа ДНК из клеток и тканей	Мачери-Нагель	740952.5	Набор для экстракции геномной ДНК
Оптима ХЕ-90	Beckman Coulter Медико-биологические науки	А94471	ультрацентрифуга
pBaEVRless	Эльс Верхойен (Inserm U1111)	Личные запросы должны быть отправлены по адресу: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Baboon Эндогенный ретровирусный Rlessгликопротеин, описанный в Girard-Gagnepain, A. et al. Псевдотипированные ЛЖ бабуина с оболочкой превосходят VSV-G-LV по переносу генов в ГСК, стимулированные ранними цитокинами и находящиеся в состоянии покоя. Blood 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Адджен	Номер 35614	Поражает гены gag вируса мышиной лейкемии и pol
pCMV-VSV-G	Адджен	8454	Оболочечный белок для получения лентивирусных и ретровирусных частиц MuLV
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS для разбавления в многопоровой воде
Полибреновый реагент для трансфекции	Миллипора Сигма	ТР-1003-Г	Катионный полимер, повышающий эффективность ретровирусной трансдукции в специфических клетках млекопитающих. Он также может обеспечить вирус-зависимое поступление олигодезоксинуклеотида (ODN) для репарации, направленной на гомологию
Сахароза, для молекулярной биологии, ≥99,5% (GC)	Сигма-Олдрич	С0389-5КГ	Сахароза для подготовки подушки для очистки Nanoblade с помощью ультрацентрифугирования
SUPERBLADE5	Адджен	134913	Пустая основа для клонирования последовательности sgRNA для использования в системе нанолезвий (Оптимизировано для повышения эффективности редактирования генома Chen B et al., 2013)
Подложка SuperSignal West Dura с увеличенным сроком службы	ThermoFisher Scientific	No 34076	Подложка HRP с усиленной хемилюминесценцией (ECL) для блоттинга Cas9
SW 41 Ti Ротор с качающимся ковшом	Beckman Coulter Медико-биологические науки	331362	Ротор для ультрацентрифугирования
SYBR Safe DNA Гелевая морилка	ThermoFisher Scientific	С33102	Альтернатива бромиду этидии для окрашивания агарозными гелями и визуализации ДНК
Т4 ДНК-лигаза	Биолаборатории Новой Англии	М0202С	ДНК-лигаза для лигирования векторов BLADE или SUPERBLADES с дуплексными олигополигонами ДНК, соответствующими вариабельной области sgRNA
Тритон-содержащий лизисный буфер	Компания Promega	Е291А	Буфер для лизиса для разрушения нанолезвий и возможности количественного определения Cas9
ПОДРОСТОК 20	Сигма-Олдрич	П9416	Для приготовления TBST

Материал Товар Кабель Товар