Методическая статья

Микроинъекция эмбриона комара: метод доставки экзогенной ДНК в желток эмбриона Anopheles gambiae для генерации мутаций зародышевой линии

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Carballar-Lejarazú, R. et al, Метод микроинъекции для эмбрионов Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы демонстрируем доставку конструкции генного драйва в эмбрион комара Anopheles gambiae с помощью техники микроинъекции эмбриона. Эта процедура позволяет интегрировать доставленную конструкцию ДНК посредством гомологичной рекомбинации в клетки зародышевой линии для создания трансформированной популяции комаров.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микроинъекция эмбриона

  1. С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглы 2 мкл смеси ДНК (плазмидной ДНК в концентрации 300-400 нг/мкл). Вставьте иглу в иглодержатель и подсоедините трубку автоматического нагнетательного насоса (рис. 1).
  2. Важно: Выровняйте иглу так, чтобы она составляла угол 15° с плоскостью предметного стекла (рисунок 1).
  3. Откройте кончик иглы, осторожно коснувшись первого яйца комара Anopheles gambiae, и введите его, вставив кончик иглы ≤ 10 мкм в задний полюс. Успешная инъекция приведет к небольшому движению цитоплазмы внутри яйцеклетки.
  4. С помощью коаксиального столика микроскопа перейдите к следующей яйцеклетке, чтобы продолжить инъекцию.
    1. Чтобы убедиться, что кончик иглы остается открытым и не засорился, нажмите кнопку «Инъекция» перед вводом еще одного эмбриона и визуализируйте маленькую каплю в месте отверстия иглы.
    2. Если игла засорилась, нажмите кнопку «Очистить», чтобы очистить иглу, и повторите тест визуализации капель. При необходимости отрегулируйте давление, если отверстие на кончике иглы становится немного больше, чтобы размер капли оставался маленьким.
    3. Введите ~40-50 яиц одной иглой.
      заметка: Следите за тем, чтобы фильтровальная бумага всегда оставалась влажной. Поддерживайте достаточное обратное давление на иглу, чтобы она оставалась очищенной. Иголку, которую невозможно прочистить от закупорки, необходимо заменить на новую иглу. Размещение эмбрионов, введение иглы и инъекция облегчаются с помощью микроскопов, которые имеют коаксиальные элементы управления горизонтальным перемещением предметного стекла (Рисунок 2).
  5. После завершения инъекций промойте яйца в стеклянный контейнер, выстланный фильтровальной бумагой и заполненный 50 мл деионизированной H2O (рис. 3).
    заметка: Эмбрионы начнут вылупляться через 2 дня после инъекции и могут занять до 3-5 дней. Вылупившихся личинок первого возраста необходимо немедленно пересадить (проверять 2 раза в день) в чистую емкость с водой и кормом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Положение иглы во время микроинъекций. А) Широкоугольный обзор стадии впрыска. B,C) Расположите иглу так, чтобы выровненные эмбрионы образовали угол 15° с помощью инъекционной иглы. Не поднимайте плечо инструмента для микроинъекций, которое удерживает иглу, значительно выше предметного столика микроскопа, чтобы обеспечить надлежащий угол между иглой и предметным стеклом, с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Буфер для микровпрыска- T- T1 мМ буфер NaHPO4, pH 6,8, 50 мМ KCl
Блоттинговая мембрана (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)Био-РадАккуратно и ровно нарезать на кусок 2х1 см
Деионизированная или дважды дистиллированная вода (ddH20)Мили-КВ бутылке для стирки
Препарирующий микроскопЛейкаЛейка MZ12Для выравнивания эмбрионов
Стеклянная тарапирексNo 3140125 х 65
Предметное стеклоБренд ФишерNo 12-549-375x26 мм
МикроинъекторИнструмент СаттераЦифровой микроинъектор XenoWorks
Наконечники для микрозагрузчика для пипетокЭппендорфМикрозагрузчик epT.I.P.S. 20 μЛ
микроманипуляторИнструмент СаттераМикроманипулятор XenoWorks
МикропипеткаРайнин20 μл
микроскопЛейкаDM 1000 LED или M165 FCДля микроинъекций
Нейлоновая сетка
малярная кистьБликNo 05831-7040Тонкая, размер 4/0
чашка ПетриПластик, (60x15 мм, 90x15 мм)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи