Микроинъекция эмбриона комара: метод доставки экзогенной ДНК в желток эмбриона Anopheles gambiae для генерации мутаций зародышевой линии

Аннотация

Источник: Carballar-Lejarazú, R. et al, Метод микроинъекции для эмбрионов Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы демонстрируем доставку конструкции генного драйва в эмбрион комара Anopheles gambiae с помощью техники микроинъекции эмбриона. Эта процедура позволяет интегрировать доставленную конструкцию ДНК посредством гомологичной рекомбинации в клетки зародышевой линии для создания трансформированной популяции комаров.

Протокол

1. Микроинъекция эмбриона

1. С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглы 2 мкл смеси ДНК (плазмидной ДНК в концентрации 300-400 нг/мкл). Вставьте иглу в иглодержатель и подсоедините трубку автоматического нагнетательного насоса (рис. 1).
2. Важно: Выровняйте иглу так, чтобы она составляла угол 15° с плоскостью предметного стекла (рисунок 1).
3. Откройте кончик иглы, осторожно коснувшись первого яйца комара Anopheles gambiae, и введите его, вставив кончик иглы ≤ 10 мкм в задний полюс. Успешная инъекция приведет к небольшому движению цитоплазмы внутри яйцеклетки.
4. С пом....

Результаты

Рисунок 1: Положение иглы во время микроинъекций. А) Широкоугольный обзор стадии впрыска. B,C) Расположите иглу так, чтобы выровненные эмбрионы образовали угол 15° с помощью инъекционной иглы. Не поднимайте плечо инструмента для микроинъекций, которое удерживает иглу, значительно выше предметного столика микроскопа, чтобы обеспечить надлежащий угол между иглой и предметным стеклом, с.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x Буфер для микровпрыска	- T	- T	1 мМ буфер NaHPO4, pH 6,8, 50 мМ KCl
Блоттинговая мембрана (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Био-Рад		Аккуратно и ровно нарезать на кусок 2х1 см
Деионизированная или дважды дистиллированная вода (ddH20)	Мили-К		В бутылке для стирки
Препарирующий микроскоп	Лейка	Лейка MZ12	Для выравнивания эмбрионов
Стеклянная тара	пирекс	No 3140	125 х 65
Предметное стекло	Бренд Фишер	No 12-549-3	75x26 мм
Микроинъектор	Инструмент Саттера		Цифровой микроинъектор XenoWorks
Наконечники для микрозагрузчика для пипеток	Эппендорф		Микрозагрузчик epT.I.P.S. 20 μЛ
микроманипулятор	Инструмент Саттера		Микроманипулятор XenoWorks
Микропипетка	Райнин		20 μл
микроскоп	Лейка	DM 1000 LED или M165 FC	Для микроинъекций
Нейлоновая сетка
малярная кисть	Блик	No 05831-7040	Тонкая, размер 4/0
чашка Петри			Пластик, (60x15 мм, 90x15 мм)