Гидродинамическая доставка генов: метод экстрагенной ДНК in vivo в гепатоцитах мышей путем инъекции в хвостовую вену

Аннотация

Источник: Hubner, E. K. et al., Конститутивные и индуцируемые системы для генетической модификации гепатоцитов мышей in vivo с использованием гидродинамической инъекции в хвостовую вену. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает технику генетической трансфекции in vivo мышиных гепатоцитов с помощью гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Эта система трансфекции генерирует долговременную экспрессию трансгена в гепатоцитах.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление раствора для гидродинамической инъекции в хвостовую жилу

Примечание: Подготовьте плазмидные конструкции для конститутивной и индуцируемой экспрессии генов методом клонирования с использованием компетентных бактерий.

1. Приготовьте стерильный 0,9% физиологический раствор для инъекций (не используйте PBS). Используйте объем, соответствующий примерно 10% от массы тела мыши. Пример: для мыши весом 20 г приготовьте 2 мл раствора.
2. Подготовьте векторы для инъекций, которые были очищены с помощью набора для очистки плазмид, не содержащего эндотоксинов.
3. Добавьте 10 мкг или 15 мкг векторной конструкции «Спящая красавица», не содержащую эндотоксинов (используйте 10 мкг, с шага 4 используйте 15 мкг соответственно) и 1 мкг pc-HSB5, не содержащего эндотоксинов, на мл стерильного физиологического раствора.
4. Храните раствор до 4 часов при 4 °C. Не замораживайте.

2. Выполнение гидродинамической инъекции в хвостовую вену

1. Используйте ограничитель для инъекций в хвостовую вену (коммерческий или приготовленный из конической трубки объемом 50 мл с отверстиями для дыхания и для хвоста). Заполните дно трубки папиросной бумагой.
2. Для инъекций используют мышей в возрасте около 8–10 недель с весом 20–25 г.
3. Взвесьте мышей перед инъекцией и подготовьте объем инъекции в соответствии с массой тела (соответствующий 10% массы тела). Подготовьте стерильный шприц объемом 3 мл с иглой 27 G для инъекций и заполните его необходимым объемом.
4. Поместите мышь в ограничитель. Отрегулируйте количество папиросной бумаги так, чтобы оставлялось минимальное пространство для движения, но достаточно места для дыхания.
5. Следите за тем, чтобы мышь регулярно дышала.
6. Согреваем хвост с помощью инфракрасной лампы в течение 30-60-х годов. Внимательно следите за признаками перегрева.
7. Очистите хвост спиртовым тампоном.
8. Вставьте иглу почти горизонтально в одну из двух боковых хвостовых жилок, расположенных близко к основанию хвоста.
   заметка: При успешном введении небольшое количество крови может течь обратно в конус иглы. Не рекомендуется проводить активную аспирацию, так как любое дополнительное движение иглы может привести к ее смещению и/или травме вены.
9. Введите весь объем в хвостовую вену в течение 8-10 с.
10. Сразу же извлеките мышь из ограничителя. Сжимайте рану для инъекций не менее 30 с или до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
11. Поместите мышь в отдельную клетку. Как только мышь восстановится после процедуры (около 30–60 минут), перенесите мышь обратно в исходную клетку. Регулярно проверяйте мышь в течение следующих 24 ч.<бр/> заметка: Легкая седация мышей обычно наблюдается в течение 2 ч после инъекции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NaCl 0,9%	Браун	3200905	Носитель для внутривенных инъекций
Сокол Коническая Трубка 50мл	Corning Медико-биологические науки	352095
Инфракрасная лампа	Н/Д	Н/Д	Для утепления мышиного хвоста
Плазмиды для клонирования спящей красавицы – векторы-транспозоны для HTVI.
пТК	н/д		Вектор для конститутивной экспрессии генов
pEN_TTmcs	Адджен	#25755	Входной вектор для индуцируемой экспрессии генов
pEN_TTGmiRc2	Адджен	#25753	Входной вектор для индуцируемой экспрессии miRshRNA с коэкспрессией GFP
pEN_TTmiRc2	Адджен	#25752	Входной вектор для индуцируемой экспрессии miRshRNA без коэкспрессии GFP
pTC АпоЕ-Тет	Адджен	#85578	Экспрессионный вектор для индуцируемого гена или экспрессии miR-шРНК с промотором ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Tet	Адджен	#85577	Экспрессионный вектор для индуцируемой экспрессии гена или miR-шРНК с промотором ЦМВ