Опосредованная агробактериями генетическая трансформация: метод генетической трансформации генома риса с помощью генетически модифицированной агробактерии Agrobacterium tumefaciens

Аннотация

Источник: Xu, D., et al. Опосредованная агробактериями генетическая трансформация, трансгенное производство и ее применение для изучения мужского репродуктивного развития в рисе. J. vis. Exp. (2020).

В этом видео мы демонстрируем генетическую трансформацию генома риса с использованием бинарного вектора Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия способствует переносу чужеродной ДНК-плазмиды с помощью белков вирулентности Agrobacterium.

Протокол

1. Генетическая трансформация риса и культура тканей растений

1. Индукция и регенерация каллуса
   заметка: Используйте свежие молодые соцветия риса в качестве исходного материала для индукции каллуса (Рисунок 1).
   1. Соберите молодые соцветия с рисового поля или теплицы в стадии мейоза, определяемой длиной цветка 1,6-4,8 мм (рис. 1А). Следите за тем, чтобы соцветия риса были покрыты листовой оболочкой. Протрите каждое соцветие 70% спиртовым тампоном и дайте ему высохнуть перед срезкой.
   2. Вынесите соцветие на чистую стерильную скамейку. Нарежьте его на мелкие кусочки (чем меньше, тем лучше) стерилизованными ножницами, а затем перенесите черенки в тарелку Петри, содержащую среду NBD2 (Рисунок 1B, Таблица 1).
   3. Инкубируйте планшет в темноте при температуре 26 °C в течение примерно 10-14 дней, чтобы вызвать каллус (рис. 2A).
      заметка: Используйте вновь образовавшуюся каллус для инфильтрации агробактерий непосредственно (шаг 1.2.7) или восстановите еще раз в свежей среде NBD2 для получения большего количества каллуса. Переносите мозоль в новую среду NBD2 каждые 8–10 дней.
2. Трансформация и совместное выращивание
   1. Для трансформации используйте бактерии A. tumefaciens, содержащие бинарную плазмиду с конструкцией sgRNA-CAS9. Для дальнейшего использования штаммы A. tumefaciens хранят в среде YEB (Таблица 1) с 50% глицерином при температуре -80 °С.
   2. Streak A. tumefaciens переходит из материала глицерина при -80 °C в среду YEB agar, содержащую селективные антибиотики (табл. 1), и выращивает при 25–28 °C в течение 48–72 ч, чтобы дать возможность появиться колониям.
   3. Инокулируйте одну колонию из планшета YEB селективными антибиотиками в 5 мл жидкой среды YEB, содержащей те же селективные антибиотики (табл. 1), в коническую стерильную пробирку объемом 50 мл. Встряхните на орбитальном шейкере при температуре 250 x g при температуре 25–28 °C, пока бактерии не вырастут до наружного диаметра₆₀₀ 0,5.
   4. Добавьте 1 мл бактериальной суспензии к 100 мл среды YEB (Таблица 1) с теми же селективными антибиотиками в коническую колбу объемом 250 мл и встряхните на орбитальном шейкере при 250 x g при 28 °C в течение 4 ч.
   5. Центрифугируйте при давлении 4 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре для сбора бактерий. Выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Суспендируйте бактериальную гранулу в среде AAM-AS (табл. 1) и разбавьте суспензию наружным диаметром₆₀₀ = 0,4.
      заметка: Идеальный внешний диаметр бактериальной суспензии имеет решающее значение для эффективной трансформации. Он помогает в устранении избыточного роста бактерий на мозоли.
   7. Соберите около 150 здоровых растущих светло-желтых хрупких эмбриогенных каллусов с шага 1.1.3 в стерильную колбу объемом 150 мл. Добавьте 50–75 мл суспензии бактериальных клеток из шага 1.2.6 в стерильную колбу, а затем добавьте немного 10–25 мл свежей среды AAM-AS, чтобы погрузить каллусы на 10–20 минут, периодически встряхивая.
   8. Тщательно вылейте бактериальную суспензию из колбы и высушите излишки бактериальной суспензии из каллуса, используя стерильную фильтровальную бумагу #1 или папиросную бумагу. Затем поместите их на чашку Петри со средой NBD-AS (табл. 1), застеленную стерильной фильтровальной бумагой #1. Инкубируйте при температуре 25–28 °C в темноте в течение 3 дней и проверьте наличие избыточного бактериального роста.
3. Отбор на резистентную мозоль
   1. После 3 дней совместного выращивания переложите каллусы в стерильную чашку Петри со стерильной фильтровальной бумагой.
   2. Высушите каллусы на воздухе в течение 2 часов на чистой скамейке. Следите за тем, чтобы мозоль не прилипла к фильтровальной бумаге.
   3. Равномерно перенесите каллусы с помощью стерильного пинцета в первичную среду отбора NBD2 (с 40 мг/л гигромицина и 250 мг/л тиментина) (Таблица 1). Культивируют каллусы в течение 2 недель при температуре 25–28 °C в темное время суток.
   4. Через 2 недели равномерно переложите каллусы на новую тарелку, содержащую свежую отборочную среду NBD2 (с 40 мг/л гигромицина и 250 мг/л тиментина) (Таблица 1). Культивируйте каллусы еще 2 недели при температуре 25–28 °C в темноте.
4. Дифференциация каллуса
   1. Перенесите каллус в свежую среду для РС (с 25 мг/л гигромицина и 150 мг/л тиментина) (Таблица 1). Культивируют под светом при температуре 25–28 °C в течение примерно 2 недель.
   2. Повторите шаг 1.4.1 еще раз.
   3. Перенесите почки побегов в новую среду MS (с 10 мг/л гигромицина) для размножения большего количества побегов.

Таблица 1: Медиа-композиции для преобразования риса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Результаты

Рисунок 1: Исходные материалы для индукции каллуса. (А) Молодые соцветия риса на стадии мейоза. (B) Рассеченные молодые соцветия, растущие на среде NBD2. Стержень = 2 см в (А).

Рисунок 2: Методика получения трансгенных линий методом Agrobacterium-опоср...