1. Электропорация для сверхэкспрессии трансгена Hh-рецептора: pEGFP-Smo
- Для электропорации с использованием кюветы с зазором 2 мм для каждой реакции электропорации готовят следующую смесь плазмидных клеток для электропорации: 1,2 × 106 клеток предшественников первичных гранулярных клеток мозжечка мыши и 10 мкг pEGFP-mSmo (отрегулируйте концентрацию запаса ДНК до ~2-5 мкг/мкл в буфере Tris-EDTA или стерильном dH2O) в 100 мкл Opti-MEM.
заметка: Уменьшите общее количество ячеек, если их недостаточно (хотя это может снизить эффективность электропорации). Однако не регулируйте количество плазмиды или общий объем Opti-MEM, используемого на одну кювету. Если общее количество ячеек, необходимое для эксперимента, превышает 1,5 × 106 ячеек, соответственно масштабировать электропориционную смесь и проводить несколько реакций электропорации по отдельности. Кювету можно использовать повторно до 5 раз.
- Подготовьте посевную пластину для постэлектропорационной ячейки, добавив 0,5 мл питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые покровные стекла, и поддерживайте ее в тепле при температуре 37 °C в инкубаторе сCO2. Чтобы подготовить покровные стекла для прикрепления клеток, инкубируйте автоклавные стеклянные покровные стекла толщиной 12 мм со 100 мкг/мл поли-D-лизина (PDL, 1 мг/мл в стерильном dH2O) в течение не менее 1 ч при 37 °C. Выдерживайте покровные стекла в том же растворе PDL при температуре 4 °C до использования.
- Дозируйте необходимое количество клеток в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и вращайте при 200 × г в течение 5 минут при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 μл Opti-MEM. Повторите этот шаг дважды с Opti-MEM, чтобы убедиться в отсутствии остатков питательной среды в пробирке.
заметка: Для каждой лунки/покровного стекла 24-луночного планшета электропорировать и затравку 1,2-1,3 × 106 клеток/лунку для получения ~70-75% конфлюенции клеток на следующий день культивирования.
- Установите параметры электропорации, как показано в таблице 1.
Осторожно издайте - пипетку в результате реакции электропорации, чтобы хорошо перемешать, и с помощью длинного наконечника P200 переместите точный объем 100 мкл смеси в кювету с зазором 2 мм. Избегайте образования пузырей.
- Поместите кювету в камеру кюветы.
- Нажмите кнопку Ω электропоратора (см. Таблицу материалов) и запишите значение импеданса, которое должно быть ~30-35. Чтобы значение электрического сопротивления Ω находилось в диапазоне 30-35, придерживайтесь точного объема 100 μл.
- Нажмите кнопку запуска, чтобы инициировать импульс.
- Запишите значения измеренного тока и джоулей, отображаемые на считывающей рамке.
- Извлеките кювету из кюветной камеры.
- Немедленно добавьте в кювету 100 μл предварительно подогретой питательной среды и повторно суспендируйте ее путем аккуратного пипетирования вверх и вниз 2-3 раза. Немедленно перенесите суспензию ячеек на 24-луночный планшет, содержащий покрытые покровные стекла, приготовленные на шаге 1.2.
заметка: Чтобы свести к минимуму гибель клеток, засейте клетки сразу после электропорации.
- Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе CO2. Оставьте клетки в покое в течение 3 часов, чтобы избежать отслоения клеток.
- Через 3 ч после посева осторожно аспирируйте и выбросьте половину надосадочной среды, чтобы удалить плавающие мертвые клетки и мусор, и замените ее таким же количеством предварительно подогретой питательной среды.
- Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе CO2.
T
T
| Настройка импульса Поринга | Настройка импульса передачи |
| Основные GCP мыши | Первичные нейроны | Основные GCP мыши | Первичные нейроны |
| напряжение | 275 В | 275 В | 20 В | 20 В |
| длина | 1 мс | 0,5 мс | 50 мс | 50 мс |
| интервал | 50 мс | 50 мс | 50 мс | 50 мс |
| Нет. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| Скорость D | 10% | 10% | 40% | 40% |
| полярность | + | + | ± | ± |
Таблица 1: Параметры электропорации первичных ОЦП и первичных нейронов мыши с использованием суперэлектропоратора типа NEPA21
