$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Нуклеофекция мерозоитов или спорозоитов
- Подготовка перед нуклеофекцией паразитов
- Приготовьте около 107 мерозоитов или спорозоитов в одной пробирке. Если переливаете мерозоиты, готовят 3-4 пробирки.
- Получить количество плазмидной ДНК или очищенного фрагмента ПЦР, которое больше или равно 10 мкг.<бр/>
заметка: Плазмида, используемая в этом исследовании, содержит 2 гена: усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP) и дигидрофолатредуктазу тимидилатсинтазу, полученную из Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
- Приготовьте 25 ЕД фермента рестрикции. Если плазмиды линеаризованы, фермент рестрикции может повысить эффективность трансфекции. Если плазмиды круглые, не используйте фермент рестрикции.
- Приготовьте 85 мкл нуклеофекционного буфера (табл. 1): смешайте 20 мкл нуклеофекционного буфера I и 1 мл нуклеофекционного буфера II и используйте часть раствора. Объем общего буфера составляет 100 μл.
- Нуклеофекция
- Центрифугируйте спорозоитную или мерозоитовую суспензию при 600 x g в течение 10 мин. Затем выбросьте надосадочную жидкость.
- В следующем порядке добавьте 85 мкл ядерного трансфекционного буфера, 10 мкг плазмиды (фрагмент ПЦР) и 25 ЕД фермента рестрикции (обычно 5 мкл) в 1,5 мл пробирки, содержащей спорозоиты или мерозоиты.
- Перенесите суспензию в ядерный стаканчик для переработки. Поместите чашку в паз для переноса ядер.
- Включите нуклеофекционный аппарат с помощью кнопки питания и выберите процедуру трансфекции U-033. Если нуклеофекционное устройство запускается в режиме Free Program Choice, выйдите из этого режима, нажав кнопку X.
- Когда программа завершится, нажмите кнопку X на устройстве нуклеофекции, и на экране должно отобразиться OK, указывающее на успешное выполнение нуклеофекции.
- Добавьте 0,5-1 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) в чашку для нуклеофекции, чтобы остановить реакцию, и перенесите суспензию в пробирку объемом 1,5 мл после осторожного перемешивания.
| буфер
|
состав
|
| Нуклеофекционный буфер I | АТФ-динатрий 2 г, MgCl2-6H 2O 1,2 г, 10 мл воды |
| Нуклеофекционный буфер II | KH2PO4 6 г, NaHCO3 0,6 г, глюкоза 0,2 г, 500 мл воды |
| *вода: дистиллированная вода | |
Таблица 1: Состав буферов.