$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Удалите кучевые клетки из оплодотворенных яйцеклеток.
- Под стереомикроскопом используйте 2 инсулиновых шприца: первый для удержания яйцевода, а второй для разрыва ампулы и диспергирования оплодотворенных яиц в рабочий раствор гиалуронидазы.
- Возьмите подготовленную стеклянную пипетку для сбора яиц и подключите ее к трубке и фильтру 0,22 мкм, установленному на мундштуке, чтобы отсасывать все яйца. Соберите все яйца и промойте их путем последовательного пропускания в 6 различных капель по 100 мкл М2 среды.
- Промытые оплодотворенные яйца поместить в увлажненный 37 °C инкубатор с атмосферой 5%CO2 в среде M16.
2. Изготовление пипеток для инъекций
- Используйте тонкостенную стеклянную капиллярную трубку (длиной 10-15 см) с наружным диаметром 1 мм и зажмите этот капилляр в горизонтальном съемнике микропипетки.
заметка: В большинстве горизонтальных пипеток можно регулировать 3 параметра: тепловую мощность, силу вытягивания и временную задержку между нагревом и вытягиванием. Отрегулируйте эти параметры, чтобы получить инъекционный пипетец, похожий на тот, который представлен на рисунке 1А. Для пользователей, которые регулярно выполняют микроинъекции ДНК, используйте стандартные настройки и отрегулируйте задержку между нагреванием и вытягиванием, чтобы изменить общую форму наконечника пипетки.
3. Изготовление пипеток для удержания
- С помощью инъекционной пипетки подготовьте пипетку для удержания.
- Прикрепите инъекционную пипетку к микрокузнечному аппарату. Разрежьте пипетку с помощью микрокузницы, чтобы получить острый симметричный наконечник диаметром от 80 до 100 мкм. Затем отполируйте наконечник с помощью термической полировки на микрокузне, чтобы получить симметричную круглую форму без острых живых изгородей.
4. Приготовление инъекционной пипетки, содержащей лентивирусный вектор
- Центрифугируйте суспензию лентивирусного вектора при давлении 160 х г в течение 2 мин для удаления остатков гранул, часто присутствующих в замороженных лентивирусных запасах.
- Извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в новую пробирку объемом 0,5 мл в безопасном шкафу класса II.
- Перенесите 1 мкл надосадочной жидкости в пипетку для инъекций, приготовленную, как описано в шаге 5, с помощью микрозагрузчика.
- Установите инъекционную пипетку на держатель инструмента правого микроманипулятора. Подсоедините удерживающую пипетку к левому микроманипулятору.
заметка: Титрование трансдукции лентивирусного вектора будет напрямую коррелировать с эффективностью продукции основателя. Для получения высокой эффективности (>70%) используйте вирусные векторы с титром в диапазоне 100 нг белка капсида p24/мкл. Когда титр выражается в единицах трансдукции (TU), титр должен быть выше 109 TU/мл. Запасы лентивирусных векторов должны быть получены путем транзиторной трансфекции клеток 293T с инкапсулирующей плазмидой p8.91, pHCMV-G, кодирующей гликопротеин-G вируса везикулярного стоматита (VSV), как описано в дополнительных методах.
5. Микровпрыск
- Во избежание испарения нанесите 8 мкл среды M2 в центр предметного стекла и накройте легким парафиновым маслом (протестированным эмбрионом).
- Положите 20 яиц в каплю как можно менее рассеянной.
осторожность: Не образуйте пузырей при отсадке эмбрионов.
- Убедитесь, что кончик пипетки для инъекций открыт. Если нет, постучите по пипетке для инъекций пипеткой, удерживающей пипетку.
- Установите микроинъектор на время впрыска 20 с.<бр/>
заметка: Вязкость вирусной суспензии позволяет наглядно визуализировать дисперсию вирусного вектора в перивителлиновом пространстве. Давление впрыска должно быть отрегулировано таким образом, чтобы заполнить все пространство в течение 20 с момента впрыска, что соответствует объему от 10 до 100 пл. Давление впрыска не должно превышать 600 гПа.
- Отасывайте одну оплодотворенную яйцеклетку, содержащую 2 пронуклеуса и 2 полярных тельца, с помощью пипетки-держателя под стереомикроскопом.
- Введите яйцеклетку с помощью микроинъектора в перивителлиновое пространство.
осторожность: Не прикасайтесь к плазматической мембране с помощью инъекционной пипетки.
- Введите все имеющиеся в наличии оплодотворенные яйца партиями по 20 яиц и немедленно поместите введенные яйца в предварительно нагретую среду M16 во увлажненный инкубатор при температуре 37 °C с атмосферой 5% CO2,
заметка: Инкубируйте введенные яйца в течение как минимум 30 минут после инъекции перед переносом эмбрионов.
