Лазерная доставка генов лентивируса: метод пермеабилизации оплодотворенных яйцеклеток мышей для облегчения доставки генов лентивирусов

Аннотация

Источник: Martin, N. P., et al. Лазерная доставка генов лентивируса в оплодотворенные яйцеклетки мышей. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы демонстрируем лазерное проникновение защитного слоя zona pellucida в оплодотворенные яйцеклетки мышей для облегчения доставки генов лентивируса. Лентивирус позволяет получать трансгенных животных с геном, представляющим интерес, стабильно интегрированным в их геном.

Протокол

1. Перфорация оплодотворенных яйцеклеток мышей с помощью лазера XYClone

1. Настройка и калибровка лазера XYClone в соответствии с рекомендациями производителя. Другие лазеры, обычно используемые для экстракорпорального оплодотворения, могут быть заменены лазером XYClone для перфорации оплодотворенных яйцеклеток.
   1. Прикрепите провод коробки лазерного контроллера к лазерному аппарату на микроскопе.
   2. Подключите блок лазерного контроллера к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение для лазера, через USB-порт. 3.1.3. Подключите лазерный контроллер и включите его.
   3. Глядя в окуляр, продырявите испытуемый образец (например, нанесите сухую разметку на предметное стекло
   ).
   4. С помощью небольшой отвертки (входит в комплект лазера) отрегулируйте положение лазера по осям X и Y в соответствии со светодиодным светом, видимым через окуляр микроскопа, и откалибруйте лазер.
2. Поместите на предметный столик КСОМ планшет с оплодотворенными яйцеклетками мыши. Не держите тарелку вне инкубатора дольше 15 минут.
3. Посмотрите в окуляр микроскопа и убедитесь, что пеллюцидная зона эмбриона находится в фокусе, а лазерный светодиодный свет виден.
4. Переместите предметный столик микроскопа так, чтобы он был направлен на зону с помощью светодиодного света/лазера.
5. С помощью компьютерного программного обеспечения установите лазер XYClone на 250 μс.
6. Отрегулируйте размер светодиодной лампы до желаемых размеров (настройка 5 в этом эксперименте).
7. Трижды перфорируйте зону каждого оплодотворенного яйца с помощью лазера. Зону можно как проколоть, так и утончить. Используя вышеуказанные настройки, лазер создаст отверстие диаметром 10 мкм (рис. 1).
   заметка: Прицеливание близко к полярному телу удерживает лазер подальше от эмбриональной клетки.
8. Дайте оплодотворенным яйцеклеткам восстановиться в течение 2 часов в инкубаторе для тканевых культур, прежде чем переходить к следующему этапу.

2. Трансдукция оплодотворенных яйцеклеток мыши после лазерной перфорации XYClone

1. Пипетировать 2 мкл концентрированного лентивируса (титр более 1e8 TU/мл) в каплю KSOM 50 μL. Не делайте пипения вверх и вниз. Оплодотворенные яйца легко прикрепляются к кончику пипетки. Исходя из нашего опыта, оптимальным для доставки генов является 1e5-5e5 трансдуцирующие единицы лентивируса в объеме менее 3 мкл.
2. Дайте оплодотворенным яйцам развиться в бластоцисту в течение 4 дней в инкубаторе. Не нужно менять носитель.

3. Безоперационный перенос трансдуцированных эмбрионов мышей псевдобеременным мышам

1. Используйте псевдобеременных мышей, через 3,5 дня после спаривания.
2. Используйте устройство для нехирургического переноса эмбрионов эмбрионов (NSET) для имплантации эмбрионов мышей псевдобеременным мышам.
   1. С помощью хирургического или препарирующего микроскопа введите вагинальное зеркало, чтобы визуализировать шейку матки.
   2. Введите устройство для нехирургического переноса эмбрионов (NSET) примерно на 5 мм в шейку матки и поместите эмбрионы в объеме примерно 2 мкл<бр/> заметка: Стерильное устройство NSET используется для каждого переноса и утилизируется после процедуры. Все реактивы, используемые при манипуляциях с эмбрионами, должны быть стерильными.
3. Пересадите 10–15 здоровых бластоцист в объеме 2 мкл КСОМ каждой псевдобеременной мышке.
4. Продолжайте отслеживать и измерять прибавку в весе у псевдобеременных мышей в последующие дни, чтобы определить, была ли NSET успешной.
5. Восстановите детенышей, позволив беременным мышам родить естественным путем или выполнив кесарево сечение через 17 дней после переноса эмбрионов. Кесарево сечение часто необходимо, если присутствует очень мало эмбрионов и они вырастают слишком большими для естественных родов.
6. Соберите ткани у детенышей для генотипирования, чтобы определить скорость трансгенеза.

Результаты

Рисунок 1: Лазерная обработка оплодотворенных яйцеклеток мышей. Примеры перфорации зоны для получения отверстия в сравнении с утончением зоны.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Плазмида CD510B-1	Системные бионауки	КД510Б-1	используется для упаковки лентивируса, экспрессирующего EF1a-copGFP
Диметилполисилоксан	сигма	ДМПС5Х	культивирование эмбрионов
Лазер XYClone	Гамильтон Торн Бионаука		перфорация оплодотворенных яиц мышей
Устройство для нехирургического переноса эмбрионов (NSET)	Паратехника	60010	NSET эмбрионов
КСОМ средний	Многородность	МР-020П-5Ф	культивирование эмбрионов
Состав КСОМ:			мг/100мл
NaCl			555
KCl			18,5
КХ2ПО4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
глюкоза			3.6
На-пируват			2.2
DL-молочная кислота, натриевая соль			0,174 мл
10 мМ ЭДТА			100μл
стрептомицин			5
пенициллин			6.3
0,5% фенол красный			0,1 мл
L-глютамин			14,6
Незаменимые аминокислоты MEM			1 мл
MEM Nonessential AA			0,5 мл
БСА			100

мм См. См. См. См.