Биолистический-опосредованный перенос генов: метод доставки интересующего гена в клетки-мишени с помощью биолистической генной пушки

Аннотация

Источник: Taylor, T., et al. Биолистическая трансформация флуоресцентного помеченного гена в условно-патогенный грибной патоген Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео мы демонстрируем протокол доставки генов, опосредованных биологическим геном, в культивируемые клетки. Этот метод обеспечивает простой метод стабильной генетической трансформации с использованием минимального количества ДНК.

Протокол

1. Подготовка ДНК

1. Подготовьте оранжевые макроносители биолистических дисков, погрузив их в 100% этанол с помощью щипцов. Поместите диски в большую чашку Петри с сушителем для сушки (убедитесь, что дририт не касается дисков).
2. После высыхания вдавите макронесущие диски в серебряные держатели дисков (предварительно протертые 100% этанолом).
3. Вихревые шарики золотого микроносителя суспендированы в 100% этаноле и аликвоте 12 мкл в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, по одной пробирке на трансформацию.
4. Добавьте в каждую пробирку по порядку: 2 мкг ДНК (предпочтительно 2 мкл 1 мкг/мкл ДНК), 10 мкл 2,5 М CaCl₂ и 2 мкл 1 М свободного основания спермидина.
5. Настройте отрицательный контроль, как в шаге 1.4, но без ДНК.
6. Сделайте каждую пробирку вихревой и инкубируйте при температуре окружающей среды в течение 5 минут. Время от времени осторожно поворачивайте каждую трубку, чтобы снова суспендировать осевшие шарики во время этой инкубации.
7. Вращайте трубки при давлении 225 x g в течение 30 секунд, чтобы гранулировать золотые шарики, покрытые ДНК. Осторожно удалите надосадочную жидкость (с помощью пипетирования или аспирации) и выбросьте.
8. Полностью суспендируйте гранулы в 600 мкл 100% этанола путем медленного пипетирования вверх и вниз.
9. Вращайте трубки при плотности 225 x g в течение 30 секунд, чтобы гранулировать шарики без упаковки. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость.
10. Суспендируйте золотые шарики с покрытием ДНК в 8 мкл 100% этанола путем медленного пипетирования вверх и вниз.
11. Нанесите пипеткой золотые шарики, покрытые ДНК, на центр биолистического диска диаметром 1 см и дайте им высохнуть.
    заметка: Высушенный золотой круг, видимый в центре биолистического диска, указывает на наличие достаточной концентрации золотых бусин><. заметка: Диски макроносителей, загруженные золотыми шариками, покрытыми ДНК, теперь готовы к использованию с генной пушкой.

2. Работа с генной пушкой

1. Включите вакуумный насос.
2. Включите газообразный гелий, поворачивая ручку против часовой стрелки до тех пор, пока на манометре не будет достигнуто давление примерно 2 200 фунтов на квадратный дюйм.
3. Включите генную пушку, щелкнув красным переключателем слева.
4. Убедитесь, что скорость потока для вакуума и вентиляционного отверстия отрегулирована таким образом, чтобы вакуум достиг 28 дюймов ртутного столба в течение 15 секунд.
5. Убедитесь, что расстояние между разрывной мембраной и макроносителем составляет примерно 3/8 дюйма.
6. Очистите всю камеру, протерев этанолом.
7. Погрузите разрывные мембраны в 100% этанол. Дайте высохнуть на стерильной поверхности (например, в чашке Петри).
8. С помощью динамометрического ключа ослабьте держатель разрывного диска. Вставьте чистую разрывную мембрану в держатель. Закрутите держатель разрывной мембраны на место и затяните динамометрическим ключом, повернув его один раз вправо.
   заметка: Разрывные мембраны будут заменяться после каждой съемки.
9. Погрузите сетчатые сита в 100% этанол. Дайте высохнуть на стерильной поверхности (например, в чашке Петри).
10. После высыхания поместите промытый сетчатый экран на белую пластиковую монтажную пластину. Поместите держатель диска макроносителя DNA стороной вниз в камеру диска. Закрутите серебряный колпачок и поместите монтажную пластину в самый высокий слот.
    заметка: Сетчатый экран будет заменяться после каждой съемки.
11. Положите на нижнюю пластину с агаром YPD, содержащую 1 М сорбит.
12. Закройте дверцу камеры и зафиксируйте на месте.
13. Нажмите и удерживайте средний красный переключатель вверх, чтобы включить вакуум и дождаться, когда вакуум достигнет 28 дюймов ртутного столба. Как только будет достигнут надлежащий уровень вакуума, переведите этот переключатель в нижнее положение. Когда все будет готово, удерживайте красный переключатель справа, чтобы выстрелить. Когда разрывная мембрана лопнет, немедленно отпустите кнопку огня и нажмите средний красный переключатель в среднее положение, чтобы прокачать патронник до 0 фунтов на квадратный дюйм.
14. Очистите разрывной диск от мусора и выключите генную пушку. Затем выключите газообразный гелий, повернув ручку по часовой стрелке, и, наконец, выключите вакуумный насос.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Золотые бусины 0,6 мкм	Био-Рад	165-2262	http://www.bio-rad.com
Основа без спермадина	Сигма- Олдрич	С0266	https://www.sigmaaldrich.com
Разрывные мембраны 1350 фунтов на квадратный дюйм	Био-Рад	165-2330	http://www.bio-rad.com
Остановка сит	Био-Рад	165-2336	http://www.bio-rad.com
Диски для макроносителей	Био-Рад	165-2335	http://www.bio-rad.com
Система PDS-1000/He	Био-Рад	165-2257	http://www.bio-rad.com
Центрифуга Microfuge 18	Бекман Коултер	Ф241.5П	www.beckmancoulter.com