$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Покрытие посуды из полиорнитина/ламинина (Po/L)
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы адаптированы для покрытия 24-луночного планшета.
- При необходимости положите в лунку стерильный покровный стекло диаметром 12 мм.
- Покройте лунки 500 мкл раствором поли-L-орнитина 10 мкг/мл, растворенным в воде.
- Дайте лункам отстояться при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Удалите раствор поли-L-орнитина и высушите на воздухе в течение 30 минут.
- Покрыть лунки на ночь при температуре 37 °C 500 мкл 3 мкг/мл ламинина в бикарбонате L-15,<бр/>
заметка: Лунки можно хранить при температуре 37 °C в течение 7 дней в инкубаторе. При длительной инкубации добавление стерильного PBS между лунками может помочь избежать испарения среды.
2. Культура моторных нейронов
- Разбавляйте МН до соответствующей плотности, обычно от 5000 до 100000 клеток в 500 мкл питательной среды на лунку в 24-луночном планшете.
заметка: Плотность затравки составляет около 30 000 и 1 500 ячеек для 6- и 96-луночных планшетов соответственно.
- Удалите раствор ламинина с помощью P1000.
- Во избежание высыхания разведенные в питательной среде MNs немедленно перенесите в пластины для покрытия.
- Инкубировать культуру в течение 2 суток при 37 °С.
3. Магнитофекция мотонейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах используемые количества предназначены для переделки одной лунки из 24-луночной пластины. Пожалуйста, обратитесь к протоколу производителя для получения информации о другом формате.
- Для получения ДНК ресуспендируют 1 г ДНК в 50 мкл питательной среды нейронов и вихре в течение 5 с. Здесь используются плазмиды размером 9 кб с промотором CAGGS (pCAGEN), контролирующим кДНК нейрофиламентов.
- Для приготовления бусинной трубки ресуспендировать 1,5 мкл бусин в 50 мкл питательной среды нейронов.
- Добавьте раствор гранул объемом 50 мкл к раствору ДНК объемом 50 мкл и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре (общий объем = 100 мкл).
- Во время этой инкубации извлеките 100 μл питательной среды из лунки, которая будет трансфицирована.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите магнитную пластину в инкубатор, чтобы нагреть ее до 37 °C.
- Перенесите 100 мкл смеси ДНК/гранул в лунку и инкубируйте планшет в течение 20–30 минут на магнитной пластине при температуре 37 °C.