1. Подготовьте ретровирусную конструкцию
- Субклонировать альфа- и бета-цепи Т-клеточных рецепторов (TCR), разделенные линкером 2A, в ретровирусный вектор на основе MSCV (например, pMIAII или pMIGII).
заметка: Линкер 2A позволяет выполнять стехиометрическое и конкордантное выражение альфа- и бета-цепей TCR из одной открытой рамки считывания. Вектор включает в себя кассету с флуоресцентным белком IRES (аметрин или GFP), которая используется для отслеживания трансдуцированных клеток и эффективности трансдукции.
- Выделите плазмидную ДНК с помощью коммерчески приобретенного набора для подготовки плазмы или аналогичного продукта. Используйте рабочую концентрацию 1-2 μг μл-1.
2. Генерация клеточных линий продуцента ретровирусных сигналов
- Используйте двухэтапный процесс для производства клеточных линий ретровирусного продуцента.
- Получение ретровируса путем транзиторной трансфекции клеток 293T тремя плазмидами (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) и вектором интереса) и получение ретровирусной надосадочной жидкости из клеток 293T для трансдукции экотропной клеточной линии-продуцента ретровирусов GP+E86.
- Выделите верхние 40% флуоресцентных экспрессирующих GP+E86 клеток-продуцентов с помощью FACS и размножайте трансдуцированные клетки-продуценты GP+E86 в качестве источника вируса.
заметка: Образование продуцентов с высоким титром имеет решающее значение для эффективной трансдукции клеток костного мозга.
3. Ретровирус-опосредованный перенос генов стволовых клеток (день -5)
- Разморозьте и культивируйте 0,5 -1,0 x 106 каждой клеточной линии продуцента GP+E86 в полной DMEM 10% (об/об.) FBS, чтобы обеспечить достаточный рост для двух сливающихся 150-мм планшетов к дню 0 данного протокола.
заметка: Размораживание 0,5 - 1,0 x 106 каждой клеточной линии GP+E86 в 10-сантиметровой пластине обеспечит 30-50% слияние на 5-й день. Это также позволяет проводить культивирование в течение 5 дней, чтобы расширить клеточные линии продуцента GP+E86 до двух сливающихся 150-мм планшетов к 0-му дню.
- Культивирование клеточной линии-продуцента ретровирусной инфекции в полной питательной среде тканей, содержащей 5% сыворотки теленка плода и ципрофлоксацин (10 мкг/мл) для предотвращения контаминации микоплазмой.
заметка: Прекратите применение ципрофлоксацина при получении вирусного надосадочной жидкости для трансдукции костного мозга. Избегайте чрезмерного роста клеточной линии-продуцента, так как это негативно повлияет на эффективность трансдукции костного мозга.
4. Культура ретровирусных клеток-продуцентов (день 0)
- Планшет 3 x 106 ретровирусных клеток-продуцентов на 150-мм планшете по 18 мл полный DMEM 20% (об/об.) FBS.
- Инкубируйте клетки-продуценты ретровирусов при 37 °C в течение ночи. Рассчитывайте на одну 150-миллиметровую пластину на 15 миллионов клеток костного мозга (примерно 2-3 мыши-донора).
5. Ретровирусный супернатант (День 1)
- На следующий день (примерно через 24 часа) соберите ретровирусную надосадочную жидкость с планшетов-продуцентов (см. шаг 4), набрав ретровирусную надосадочную жидкость непосредственно со 150-миллиметровой пластины с помощью шприца объемом 10 мл, и отфильтруйте с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
- Осторожно замените удаленный ретровирусный надосадочный агент 18 мл свежего полного DMEM 20% (об/об.) FBS.
- Дополните отфильтрованную ретровирусную надосадочную жидкость ИЛ-3 (20 г мл-1), ИЛ-6 (50 г мл-1), МССКФ (50 г мл-1) и гексадиметрина бромид (полибрен) (6 мкг мл-1).<бр/>
заметка: Гексадиметрина бромид следует принимать в свежем виде каждые 2 месяца, чтобы избежать снижения эффективности ретровирусной трансдукции.
6. Ретровирусная надосадочная жидкость и трансдукция (День 2)
- Через 24 часа соберите свежую вирусную надосадочную жидкость из клеточной линии вируса-продуцента. Отфильтруйте ретровирусную надосадочную жидкость с помощью шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра длиной 0,45 мкм. Дополните отфильтрованную ретровирусную надосадочную жидкость ИЛ-3 (20 г мл-1), ИЛ-6 (50 г мл-1) и СКФ (50 г мл-1), а также гексадиметрина бромид (6 г мл-1).
- Далее осторожно удалите с помощью пипетки или аспирируйте верхние 2 мл среды из каждой лунки шестилуночного планшета, содержащего клетки костного мозга.
заметка: Работайте осторожно, чтобы не допустить аспирации костного мозга, который обычно сосредоточен в середине колодца. В качестве альтернативы, удаленный надосадочный слой может быть использован для восстановления любых потерянных клеток костного мозга.
- В каждую лунку в 6-луночный костный мозг добавляют по 3 мл свежей вирусной надосадочной жидкости, содержащей цитокины и гексадиметрина бромид. Оберните планшеты в пластик и повторите спиновую трансдукцию при 1000 x g в течение 60 мин при 37 °C. Разверните планшеты и инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи (около 24 часов).
7. Добавление свежедополненного DMEM (День 3)
- Через 24 часа удалите верхние 2 мл среды из каждой лунки шестилуночного планшета, содержащего клетки костного мозга, как в шаге 6.2. Замените удаленную среду свежим DMEM 20% (об/об.) FBS с добавлением конечных концентраций IL-3 (20 г мл-1), IL-6 (50 г млл-1) и SCF (50 г мл-1).
- Инкубируйте планшеты костного мозга при 37 °CCO2 в инкубаторе еще 24 часа.
