Окрашивание маслом красного цвета: методика окрашивания нейтральными липидами в гепатоцитах для выявления стеатоза печени in vitro

Аннотация

Источник: Campos-Espinosa, A. et al., Модель экспериментального стеатоза in vitro: культура клеток гепатоцитов в среде, кондиционированной с перегрузкой липидами. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем окрашивание нейтральных липидов в гепатоцитах in vitro для обнаружения стеатоза печени или чрезмерного накопления жира в печени. Избыток жира накапливается в клетках в виде липидных капель. Масло Red O представляет собой жирорастворимый краситель, который связывается с внутриклеточными нейтральными липидами в этих липидных каплях. При наблюдении под световым микроскопом эти внутриклеточные липидные капли имеют интенсивный красный цвет.

Протокол

1. Окрашивание липидов масляно-красным O

1. Поместите покровную крышку для клеточных культур в каждую лунку в 24-луночном планшете.
2. Засейте 100 000 клеток HepG2 в лунку. Добавьте 1 мл стандартного RPMI 1640.
3. Предварительно инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов.
4. Замените стандартную среду RPMI 1640 на стеатогенную среду.
5. Инкубировать в течение 24 часов, 2 дней, 3 дней и 4 дней, обновляя стеатогенную среду каждые 24 часа.
6. По прошествии подходящего времени выбросьте надосадочную жидкость.
7. Умойтесь 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Выбросьте надосадочную жидкость.
8. Закрепить 1 мл 4% параформальдегида в PBS.
9. Выдерживать в течение 1 ч при комнатной температуре.
10. Откажитесь от избытка параформальдегида.
11. Промойте клетки 1 мл дистиллированной воды.
12. Добавьте 1 мл 70% изопропанола и инкубируйте в течение 5 минут.
13. Откажитесь от избытка изопропанола. На этом этапе промывка PBS не требуется.
14. Добавьте 1 мл раствора Oil-red O и выдерживайте 30 минут.
15. Выбросьте излишки масляно-красного раствора O.
16. Смойте 1 мл дистиллированной воды.
17. Добавьте 500 мкл раствора гематоксилина. Выдерживать 3 мин.
18. Откажитесь от избытка раствора гематоксилина.
19. Смойте 1 мл дистиллированной воды.
20. Наблюдайте под микроскопом при увеличении 400x (объектив 40x, окуляр 10x).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Питательные среды RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, США	31800-022 (Английский)	- T
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher-Gibco, США	A4766801	- T
Клеточная линия HepG2	ATCC, США	НВ-8065	Гепатоцеллюлярная карцинома клетки человека.
Увлажненный инкубатор	Thermo Electronic Corporation, США	Модель: 3110	Температура (37 °C ± 1 °C), влажность (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%)
Инвертированный микроскоп Eclipse	NIKON, JPN	Модель: TE2000-S	- T
Изопропанол	Сигма-Олдрич, США	И9030-4Л	- T
Масляный красный комплект O	Abcam, США	АБ150678	Набор для гистологической визуализации нейтрального жира.
Параформальдегид	Сигма-Олдрич, США	П6148-500Г	- T
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFisher-Gibco, США	15140-122	Антибиотики 10 000 ед/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина
Фосфатно-солевой буфер	ThermoFisher-Gibco, США	10010-023	- T
Серологические пипетки	Сарштедт, Австралия	86.1253.001 Материал 86.1253.001	Безпирогенный, стерильный, 5 мл
Серологические пипетки	Сарштедт, Австралия	86.1254.001	Непирогенный, стерильный, 10 мл
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич, США	С5761-1КГ	Приготовление питательных сред
Олеат натрия	Санта-Круз Биотехнология, США	sc-215879A	- T
Пальмитат натрия	Санта-Круз Биотехнология, США	СК-215881	- T
Трипсин 0,05% /ЭДТА 0,53 мМ	Corning, США	25-052-Кл	- T
24-луночный кластер клеточных культур	Corning, США	No 3524	Плоское дно с крышкой. Культура тканей обработана. Непирогенный, полистирол, стерильный. 1/Упаковка.