$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Флуориметрическое количественное определение нейтральных липидов с использованием нильского красного
ПРИМЕЧАНИЕ: Для показа флуоресценции требуется всего 10 μл водорослевой суспензии в концентрации 5 г/л. Как правило, выделения сухой биомассы водорослей из 1,5 мл отвара культуры более чем достаточно. Кроме того, интенсивность света лампы в спектрофотометре может со временем ухудшаться. Рекомендуется включать стандарты в каждый эксперимент, чтобы гарантировать, что изменения в приборе не добавят ненужной погрешности к измерениям.
- Приготовьте раствор нильского красного цвета в концентрации 10 мкг/мл растворенного в спирте реагента марки этанола. Храните этот раствор в темноте при температуре 4 °C.
- Приготовьте 30% раствор этанола в деионизированной воде и храните при температуре 4 °C.
- Подготовьте все образцы водорослей при одинаковой концентрации биомассы (рекомендуется 5 г/л) и таким же образом, как и стандарты, использованные при измерении. Для этого необходимо либо суспендировать предварительно высушенные образцы в соответствующем количестве фосфатного буфера (0,6 г/л диосновного фосфата калия, 1,4 г/л моноосновного фосфата калия), либо скорректировать концентрацию растущей культуры водорослей до 5 г/л с помощью фосфатного буфера после измерения мутности><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения, выполненные на живых культурах водорослей, часто будут иметь большую погрешность, связанную с ними, в зависимости от точности калибровочной кривой мутности. Для повторного взвешивания высушенных образцов может потребоваться использование гомогенизатора для полного диспергирования биомассы.
- Для каждого образца смешайте 80 мкл 30% раствора этанола, 10 мкл раствора Nile Red и 10 мкл водорослевой суспензии в одной лунке 96-луночного планшета. Чтобы правильно учесть вариабельность измерения флуоресценции, выполните 5 повторений каждого образца.
- Проведите двухточечную калибровочную кривую со стандартами, чтобы учесть ежедневные изменения в приборе и подготовке. Подготовьте стандарты для измерения флуоресценции с использованием той же процедуры, что и для образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для повторной калибровки прибора достаточно двух точек, для проверки линейности можно запустить три точки.
- Выполните флуоресцентные измерения в спектрофотометре с многолуночным планшетным считывателем. Было обнаружено, что следующие условия дают наиболее стабильные результаты:
- Встряхивайте при 1 200 об/мин, орбита 3 мм, в течение 30 секунд.
- Выдерживать при температуре 40 °C в течение 10 минут.
- Встряхивайте при 1 200 об/мин, орбита 3 мм, в течение 30 секунд.
- Рекордная флуоресценция, возбуждение на длине волны 530 нм, излучение на длине волны 604 нм.
- Преобразуйте измерения флуоресценции в содержание масла, используя результаты внутренних стандартов.