Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление реагентов
- Изоляция и кальцификация ВСМК мышиной аорты
- Раствор для сбраживания аорты:
- Приготовьте свежий раствор (~3-5 мл на собранную аорту) со сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), содержащим 175 Ед/мл коллагеназы 2-го типа и 1,25 Ед/мл эластазы. Простерилизуйте раствор с помощью вакуумной фильтрующей системы с магнитной волной 0,22 мкм и держите на льду до использования.
- Клеточные среды:
- Добавьте 500 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Перед использованием нагрейте среду до 37 °C.
- Средицы для кальцинации:
- Среда кальцификации А (NaPhos; используется в клеточных линиях мыши):
- Дополните 100-500 мл DMEM (объем по мере необходимости) 10% фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ фосфата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Перед использованием нагрейте среду до 37 °C.
Или
- Среда для кальцификации B (βGP/Asc/DEX; используется в клеточных линиях мыши или человека):
- Дополните 100-500 мл DMEM (объем по мере необходимости) 10% фетальной бычьей сывороткой, 10 мМ β-глицерофосфатдинатрия, 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты, 10 нМ дексаметазона, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Перед использованием нагрейте среду до 37 °C.
2. Вскрытие мыши
- Усыпите мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала в дозе 200 мг/кг.
- Уложите животное лежа на доску для вскрытия и стабилизируйте, прикрепив каждую лапу к доске. С помощью препарирующего микроскопа и маленьких ножниц сделайте разрез по средней линии, идущий от нижней части живота до верхней части грудной клетки.
- Отклейте кожу щипцами и удалите брюшину, обнажив органы брюшной полости. Удалите органы желудочно-кишечного тракта, стараясь не пересечь аорту.
- Сделайте боковой разрез в передней диафрагме и продолжайте разрез по всей брюшной полости. С помощью ножниц для рассечения освободите грудную клетку, разрезав боковые стороны ребер и удалив мягкие ткани, прилипшие к верхней части грудины. Удалите грудную клетку, обнажив легкие.
- Первоначально оставьте сердце на месте (чтобы облегчить идентификацию и расслоение проксимального отдела аорты) и осторожно удалите легкие. Удаляйте тимус, трахею и пищевод с осторожностью, следя за тем, чтобы аорта оставалась неповрежденной.
- С помощью прямых тонких щипцов и микрорассекающих ножниц удалите мягкие ткани, окружающие аорту, от бифуркации подвздошной кости до дуги аорты, уделяя особое внимание при удалении околоаортального жира (рис. 1А). Удалите оставшийся жир и мягкие ткани, окружающие крупные ветви дуги аорты (т.е. брахиоцефальную, общую сонную и подключичную артерии, рисунок 1B).
заметка: Важно удалить жир из аорты, потому что жир может усилить фоновый сигнал при выполнении флуоресцентной визуализации.
- Извлеките сердце из грудной полости, аккуратно отделив его от проксимального отдела аорты, и выбросьте. Пересеките дистальный отдел аорты в месте бифуркации подвздошной кости. С помощью инсулиновой иглы введите в аорту обычный физиологический раствор из дуги аорты, чтобы вымыть оставшиеся клетки крови. Отделите аорту вместе с сосудами дуги аорты, полностью удалив ее из организма.
- Поместите аорту в обычный солевой раствор на лед до готовности к визуализации.
3. Выделение первичных гладкомышечных клеток сосудов аорты мыши
- Поместите аорту в холодный HBSS до тех пор, пока не будет завершено расслоение. Осторожно отрежьте оставшийся околоаортальный жир и мягкие ткани, оставив только аорту.
- Под стерильным капюшоном для культуры тканей перенесите аорты в раствор для сбраживания аорты в чашках для культуры тканей размером 35 мм x 10 мм. Поместить в инкубатор при температуре 37 °C на 30 мин с легким прерывистым покачиванием. После пищеварения аорты имеют растянутый или изношенный вид.
- С помощью диссекционного микроскопа и стерильных щипцов удалите наружный адвентициальный слой аорты, сохраняя медиальный слой нетронутым. Одним из методов удаления адвентиции является снятие внешнего слоя аорты с одного конца и удаление его из нижележащего медиального слоя, как будто можно снять и снять носок.
- После удаления адвентициального слоя поместите оставшуюся аорту в новую чашку для культуры тканей с питательной средой для клеточных культур и храните при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 2-4 часов.
- Под стерильным капюшоном и с помощью стерильных микродиссекционных ножниц 3 мм разрежьте аорту на кольца шириной 1-2 мм.
- Поместите эти кольца в новую чашку для культуры тканей с раствором для пищеварения аорты и инкубируйте при температуре 37 °C с легким прерывистым покачиванием в течение 120 мин. Пипеткой несколько раз в течение этой инкубации подавайте раствор вверх и вниз для ресуспензии клеток.
- Добавьте в раствор для разложения 5 мл теплой среды для клеточных культур и переложите в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 200 x g.
- Аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в желаемом объеме среды для клеточных культур (например, 5 мл).
- Поместите все количество выделенных клеток из каждой аорты в колбу для клеточных культур диаметром 25см2 и инкубируйте при температуре 37 °C с 5%CO2. Размножайте клетки с помощью стандартных методов, описанных ранее. В течение первых 7-10 дней инкубации меняйте среду каждые 72-96 часов. По мере приближения клеток к слиянию обновляйте среду чаще (каждые 48 часов).
заметка: Для того, чтобы вырастить достаточное количество клеток, может потребоваться много недель.
- После слияния клетки проходят через трипсин, который нагревают до 37 °С.
- Добавьте 0,5-1,0 мл трипсина в каждую культуральную колбу и инкубируйте в течение 3-5 минут; осторожно постукивая по стенке колбы каждые 30-60 секунд по мере необходимости, чтобы оторвать клетки от поверхности.
- Как только клетки отделятся от дна колбы, добавьте к клеткам трипсин 10 мл клеточной среды. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут. Аспирируйте среду и трипсин из клеточной гранулы. Ресуспендируйте клетки в желаемом количестве свежей клеточной среды (например, 5-10 мл) и переложите в новую колбу (при этом некоторые клетки переносят на предметное стекло камеры).
- При первом прохождении клеток подтвердите линию гладкомышечных клеток стандартными иммуноцитохимическими методами, как описано ранее, с использованием антитела, направленного против α-гладкомышечного актина.
4. Индуцирование кальцификации культивируемых гладкомышечных клеток
- Пластинчатые ячейки, полученные из 3.12 в 6-луночном формате.
заметка: Начиная с 1 x 10, рекомендуетсяиспользовать 5 клеток/лунку в общем объеме 2,0 мл клеточной среды на лунку.
- Позвольте клеткам расти в кальцификационной среде A или B в течение как минимум 7 дней в формате 6-луночных планшетов. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%CO2.
- Меняйте клеточные среды каждые 48 часов.
5. Оценка кальцификации VSMC с помощью метода окрашивания фон Косса
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод фон Косса для измерения кальцификации внеклеточного матрикса тканей или культивируемых клеток основан на замене связанных фосфатами ионов кальция ионами серебра. В присутствии легких и органических соединений ионы серебра восстанавливаются и визуализируются как металлическое серебро. Любое непрореагировавшее серебро удаляется путем обработки тиосульфатом натрия. Протокол окрашивания фон Косса следующий:
- Аспиратная среда из планшетов для культивирования клеток.
- Зафиксируйте клетки, поместив их в 1 мл 10% формалина при комнатной температуре на 20 мин.
- Удалите формалин и промойте неподвижные ячейки дистиллированной водой в течение 5 минут.
- Инкубируйте клетки в 1 мл 5% раствора нитрата серебра под лампой мощностью 60-100 Вт в течение 1-2 часов.
- Отсадите раствор нитрата серебра и промойте дистиллированной водой в течение 5 минут.
- Удалите непрореагировавшее серебро, поместив клетки в 1 мл 5% раствора тиосульфата натрия (w/v) в дистиллированную воду на 5 минут.
- Промойте ячейки дистиллированной водой в течение 5 мин. Повторите промывки 3 раза. Краситель фон Косса готов к визуализации с помощью стандартной микроскопии в инвертированном свете.
- Дополнительный шаг: Смажьте 1 мл ядерного быстрого красного в течение 5 мин. Затем три смывания дистиллированной водой (по 5 мин каждое).
