Капсульное негативное окрашивание образцов вирусов на сетках ПЭМ: метод окрашивания тяжелыми металлами для визуализации ультраструктуры оболочечных вирусов

Аннотация

Источник: Blancett, C. D., et al. Использование капсул для негативного окрашивания вирусных образцов в биоизоляции. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео мы демонстрируем отрицательное окрашивание образцов вируса в оболочке с помощью капсулы для обработки в среде биоизоляции. Отрицательно окрашенные вирусы могут быть визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии для исследования структуры и морфологии вируса с нанометровым разрешением.

Протокол

1. Капсульный метод инактивации в биоизоляции с 2% глутаральдегидом с последующим отрицательным окрашиванием в лаборатории BSL-2

1. Процедура инактивации вируса.
   1. Внутри биозащитной оболочки BSC хорошо перемешайте вирусную суспензию с тем же объемом 4% глутаральдегида до достижения конечной концентрации 2% глутарового альдегида.
      осторожность: Глутаральдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов времени в обычном BSC, но для длительного открытого использования реагента требуется работа в канальном BSC или вытяжном шкафу для химических веществ.
   2. Инактивируйте вирусы с помощью фиксатора в течение как минимум 24 часов перед упаковкой, обеззараживанием и транспортировкой в установку BSL-2 EM.
2. В установке BSL-2 EM аспирируйте вирус и фиксирующую смесь в капсулу, содержащую две сетки ПЭМ, прикрепленную к пипетке.
3. Поместите пипетку горизонтально на 10 минут так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально.
   заметка: Это необходимо для обеспечения равномерного распределения вирусных частиц по сеткам TEM.
4. Возьмите в руки пипетку и нажмите на поршень, чтобы вытолкнуть вирус в контейнер для отходов. Отасуньте 40 μл воды dI в капсулы и выдавите ее в контейнер для отходов в течение 3 циклов ополаскивания.
5. Аспирируйте 40 мкл либо 1% уранилацетата (UA), либо 1% фосфорвольфрамовой кислоты калия (ТФК) в капсулы в течение 30 с.<бр/> заметка: Время окрашивания варьировало от 10 с до 1 минуты в зависимости от образца вируса.
   осторожность: UA является альфа-излучателем и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ним с соответствующей защитой.
6. Извлеките капсулу из пипетки и промокните насухо решетки, прикоснувшись краем сетки к листу фильтровальной бумаги. Высушите решетки на воздухе и сохраните их для последующей визуализации ПЭМ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сетки ПЭМ с формваром/углеродным покрытием	SPI	3420C-MB	200 меш Cu Pk/100
Капсулы mPrep/g	ЭМС	85010-01	коробка
Муфты mPrep/f	ЭМС	85010-11	Стандарт 16/Пк
Glutaraldehdyde	ЭМС	16320	50% раствор, ЭМ класс
Уранилацетат	ЭМС	No 22400	порошок
Калия фосфовольфрамовая кислота	ЭМС	19500	порошок
фильтровальная бумага	ватман	1450-090	Размер 50
Электронный микроскоп с трансмиссией	ДЖЕОЛ	ДЖЕМ-1011	ТЭМ