$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Протокол окрашивания эозином
- Для фиксации образцов мягких тканей заполните центрифужную пробирку объемом 50 мл фиксирующим раствором, содержащим 9,5 мл 4% (v/v) раствора формальдегида (FA) и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты (AA).
заметка: Приготовьте свежеприготовленный раствор ЖК из 37% бескислотного раствора ЖК, стабилизированного примерно 10% метанола. Дополнительно разбавьте раствор FA фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS). Выбирайте DPBS без кальция и магния. Хранить разведенный раствор ЖК следует не дольше одного месяца. Во время подкисления рН фиксирующего раствора изменяется от нейтрального до примерно 3,<бр/>
осторожность: Поскольку ФА является острым органотоксичным, коррозионным и канцерогенным веществом, использование вытяжного шкафа является обязательным, а также необходимо использовать соответствующие защитные средства индивидуальной защиты.
- Добавьте только что извлеченный образец мягких тканей в центрифужную пробирку объемом 50 мл и охладите центрифужную пробирку объемом 50 мл в течение 24-72 ч.<бр/>
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
- Промойте образец мягких тканей раствором DPBS в течение 1 часа.
- Чтобы окрасить зафиксированный образец мягких тканей (например, целую почку мыши), поместите мягкие ткани в 2 мл раствора эозина Y-окрашивания и инкубируйте образец в течение 24 ч. Держите образец на горизонтальной встряхивающей пластине для плавного покачивания (около 60 об/мин) во время процесса инкубации.
заметка: Раствор для окрашивания эозина Y имеет концентрацию 30% (w/v) в дистиллированной воде. Выбирайте объем окрашивающего раствора таким образом, чтобы образец был полностью покрыт окрашивающим раствором и позволял образцу свободно перемещаться в контейнере для образца. Время инкубации может отличаться для других образцов и должно быть соответствующим образом скорректировано.
- После окрашивания осторожно извлеките образец мягких тканей из контейнера для образца.
- Аккуратно удалите излишки красителя целлюлозной папиросной бумагой.
- Поместите образец мягких тканей в конический контейнер для образцов над паровой фазой этанола для хранения и дальнейшего использования.
заметка: Конический контейнер для образцов всегда должен содержать несколько капель 70% этанола на дне пробирки, чтобы образец мягких тканей оставался влажным и предотвращал образование артефактов.