$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление растворов для окрашивания
- Отфильтруйте исходный раствор гематоксилина Harris, чтобы удалить все твердые частицы, которые выпали в осадок.
- Сложите кофейный фильтр пополам так, чтобы фильтр создал конус. Откройте боковую панель так, чтобы жидкость прошла через фильтр, позволяя улавливать любой мусор.
- Поместите фильтр внутрь воронки, а воронку — в стеклянную бутылку с фильтрующим материалом. Постепенно вливаем бульон гематоксилин через фильтр.<бр/>
осторожность: Гематоксилин опасен при попадании в глаза, проглатывании и вдыхании. Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки и работайте со стоковым раствором в химическом капюшоне.
- Приготовьте 0,05% HCl, добавив 125 мкл 12 Н HCl к 250 мл ddH2O.
- Приготовьте смесь раствора эозина Y-флоксина В, смешав в стеклянном флаконе 25 мл 1% эозина Y (aq), 2,5 мл 1% флоксина B (aq), 195 мл 95% этанола и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Хорошо перемешайте и храните при температуре RT
осторожность: Эозин Y опасен при попадании в глаза, проглатывании и вдыхании. Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки и работайте со стоковым раствором в химическом капюшоне.
- Приготовьте 2% этанол, добавив 2 мл чистого этилового спирта к 98 мл яичной воды.
осторожность: Этиловый спирт является раздражителем для глаз. Всегда надевайте надлежащие защитные средства при работе с этиловым спиртом. Он также легковоспламеняющийся, и с ним следует обращаться и хранить соответствующим образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий 2% этанол каждый раз перед проведением острой обработки этанолом.
2. Окрашивание парафиновых срезов гематоксилином и эозином
- Депарафинизируйте предметные стекла, погрузив их в 100% ксилол на 15 минут; замените его на свежий 100% ксилол еще на 15 минут.
- Восстановите гидратацию предметных стекол, окунув их в следующую серию отсортированного этанола до тех пор, пока жидкость не станет чисто стекать со стекол. Для каждого раствора окуните 8-10 раз, по 2 с на погружение: 100% этанол, 100% этанол, 95% этанол, 95% этанол, 70% этанол, 50% этанол, 30% этанол и деионизированную воду><.
заметка: Здесь протокол можно остановить, а слайды оставить на RT в воде на несколько часов. При необходимости предметные стекла могут храниться при температуре 4 °C в воде O/N.
- Поместите предметные стекла в 100% фильтрованный гематоксилин Харриса на 4 мин. Немедленно переложите их обратно в емкость с деионизированной водой. Запустите деионизированную воду в дальний от секций задний угол контейнера. Периодически опорожняйте емкость, пока вода не перестанет быть фиолетовой.
заметка: Не позволяйте воде стекать прямо на горки, так как секции могут оторваться от горок.
- Быстро проверьте интенсивность гематоксилина на препарирующем микроскопе с помощью фонарей на гусиной шее; не допускайте высыхания предметных стекол. Если пятно достигло нужной интенсивности, переходите к следующему шагу. Если цвет недостаточно темный, поместите предметные стекла в 100% гематоксилин на 1 минуту и повторите промывку водой, прежде чем снова проверить.
заметка: Гематоксилин должен быть достаточно темным, чтобы цвет не терялся во время окрашивания эозином. Однако, если в цитоплазме наблюдается окрашивание гематоксилином, срезы перекрашиваются.
- Дважды опустите предметные стекла в 0,05% HCl и сразу же перенесите их обратно в емкость с чистой деионизированной водой. Слейте воду и дважды наполните емкость водой.
- Перенесите предметные стекла на 95% этанол на 30 с, а затем переложите их в новую емкость с 95% этанолом на 30 с.
- Поместите предметные стекла в раствор эозина Y-флоксина В на 2 мин. Перенесите предметные стекла обратно в прежнюю емкость с 95% этанолом и быстро проверьте интенсивность цвета под препарирующим микроскопом. Если окрашивание достаточное, переходите к следующему шагу. Если нет, вернитесь к раствору эозина на 30 с, проверьте еще раз и повторите при необходимости.
заметка: Достаточное окрашивание эозином имеет ярко-розовый цвет и проявляется в явном контрасте с окрашиванием гематоксилином. Обязательно сотрите любой раствор с обратной стороны предметного стекла при проверке под микроскопом, чтобы не наблюдалось ложного цвета. Поскольку эозин на 95% состоит из этанола, длительное использование 95% этанола при проверке интенсивности цвета может привести к вымыванию части цвета.
- Перенесите предметные стекла на 100% изопропанол на 15 с. Замените их свежим 100% изопропанолом и поместите предметные стекла обратно в изопропанол еще на 15 с. Повторите этот процесс в общей сложности 6 стирок изопропанолом.
осторожность: Изопропанол является раздражителем глаз и дыхательных путей. Всегда обязательно надевайте надлежащие защитные средства и избегайте брызг. Он также легко воспламеняется и должен храниться и обращаться соответствующим образом.
заметка: Чтобы сэкономить на реагентах, откажитесь только от первой (самой розовой) промывки изопропанола. Храните остальные пять моющих растворов во флаконах с номерами от 1 до 5, чтобы использовать их повторно для следующего окрашивания. При повторном использовании стирки начните с флакона с номером «1» и выбросьте после использования. После того, как средство для мытья «2» было использовано, перелейте его в бутылку «1» и так далее. Завершающей промывкой всегда должен быть свежий изопропанол.
- Поместите слайды в 100% ксилолы на 3 мин. Снимайте по одному слайду за раз и установите покровное стекло.
- Добавьте достаточное количество монтажной среды, чтобы покрыть секции, и окуните их в 100% ксилол.
заметка: Этот шаг сгладит поверхность монтажного носителя и удалит любые пузыри.
- Нанесите покровное стекло на нижнюю часть горки.
заметка: Монтажный материал должен удерживать затвор в нужном положении. Если покровная крышка не прямая или не полностью сидящая, осторожно постучите по ней.
- Промокните излишки монтажного материала на бумажном полотенце, пока не будет видна только тонкая линия. Окуните салфетку в ксилол и протрите заднюю часть предметного стекла, чтобы удалить скопившуюся среду. Положите предметное стекло на прочную, но подвижную поверхность, например, на кусок картона. Застегните все оставшиеся слайды таким же образом. Дайте ксилолу испариться в вытяжке в течение 10 мин.<бр/>
заметка: Любые материалы, загрязненные ксилолом, должны быть удалены и выброшены в герметичный контейнер в капюшоне, чтобы предотвратить утечку паров.
- Дайте монтажному материалу затвердеть при RT O/N.
3. Визуализация и хранение испачканных слайдов
- Срезы изображения на сложном инвертированном микроскопе.
заметка: Горки можно держать при комнатной температуре неограниченное время.