Окрашивание метиленовым синим для оценки образования метастатической колонии in vitro: процедура окрашивания для оценки метастазирования путем количественного определения раковых клеток, собранных на мышиной модели рака

Аннотация

Источник: Nagai-Singer, M. A., et al. использование компьютерного анализа изображений для улучшения количественной оценки метастазов в легких в модели рака молочной железы 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы описываем процедуру окрашивания метиленовым синим для количественной оценки метастатической нагрузки путем подсчета окрашенных колоний, полученных путем культивирования раковых клеток, собранных из отдаленных органов мышиной модели после инъекции.

Протокол

Все процедуры на животных были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе должны быть выполнены с использованием стерильной техники.

1. Нанесите этикетку на 1 коническую пробирку объемом 15 мл на каждую мышь и добавьте в каждую пробирку 2,5 мл смеси коллагеназы IV типа и 30 единиц эластазы. Чтобы приготовить смесь коллагеназы IV типа, растворите 2 мг коллагеназы IV типа на мл 1x HBSS и стерильный фильтр. Его можно хранить до 12 месяцев при температуре -20 °C и размораживать при необходимости.
2. Перенесите собранное легкое мыши во второе, очистите 1x HBSS лунку для этого образца. Взболтайте с помощью щипцов, чтобы удалить остатки крови. Переложите чистое легкое в пустой 3,5-сантиметровый планшет для культуры тканей. Пропустите легкие через мясорубку ножницами. Промойте планшет 2,5 мл 1x HBSS, перенесите 1x HBSS и кусочки легких в коническую пробирку объемом 15 мл, уже содержащую коктейль коллагеназы/эластазы (всего 5 мл).
3. Инкубируйте в течение 75 минут при температуре 4 °C. Продолжайте смешивать образцы в течение этого времени, поэтому поместите пробирки на коромысло или вращающееся колесо. На этом этапе инкубации промаркируйте центрифужные пробирки объемом 50 мл и планшеты для культивирования тканей объемом 10 см для каждой мыши. При разведении пометьте достаточное количество 10-сантиметровых планшетов для разведения тканей.
   заметка: Наклейте этикетку на крышку планшетов для культуры тканей. Если маркировать саму пластину, надпись будет мешать анализу Fiji-ImageJ.
4. Увеличьте общий объем каждой пробирки до 10 мл с помощью 1x HBSS. Вылейте содержимое через клеточный фильтр 70 μм в коническую пробирку объемом 50 мл для каждого образца. С помощью поршня шприца объемом 1 мл аккуратно протрите образец через сетчатое фильтр, чтобы пропустить больше клеток.
5. Центрифугируйте в течение 5 минут при 350 х г при комнатной температуре (RT). Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулы 10 мл 1x HBSS. Повторите этот шаг дважды.
6. Ресуспендируйте гранулы в 10 мл 60 мкМ 6TG полной питательной среды, RPMI или IMDM. Образцы планшетов в 10-сантиметровые планшеты для клеточных культур, при желании используя схему разведения. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1:2, 1:10 и 1:100 являются распространенными разведениями, которые необходимо определить эмпирически на основе параметров исследования><. ВНИМАНИЕ: 6TG токсичен. Соблюдайте осторожность при обращении и соблюдайте все рекомендации по охране окружающей среды, здоровья и безопасности при утилизации.

2. Окрашивание пластин

1. Слейте питательную среду с планшетов в соответствующий контейнер для отходов. Зафиксируйте клетки, добавив 5 мл неразбавленного метанола на тарелку, и инкубируйте в течение 5 минут при RT, стараясь взболтать метанол так, чтобы он покрывал всю пластину><. осторожность: Метанол опасен при попадании в организм, вдыхании или попадании на кожу. Для этого шага используйте вытяжной шкаф
.
2. Высыпьте метанол с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Промойте тарелки 5 мл дистиллированной воды на тарелку и налейте воду в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте 5 мл 0,03% метиленового синего на тарелку и инкубируйте в течение 5 минут при RT, следя за тем, чтобы раствор метиленового синего был покрыт всей пластиной.
3. Насыпьте метиленовый синий в соответствующий контейнер для отходов. Еще раз промойте тарелки 5 мл дистиллированной воды на тарелку. Переверните тарелки вверх дном и промокните на бумажном полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Поместите тарелку на крышку и дайте высохнуть на воздухе в течение ночи при RT.
   заметка: Метастатические колонии будут синего цвета. После высыхания пластин их можно хранить в RT в течение неограниченного времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
метанол	Научный центр Фишера	А412СК-4
Метиленовый синий	Сигма-Олдрич	03978-250МЛ
RMPI-1640 Средний	АТКС	30-2001
Коромысло или вращающееся колесо	любой	любой
Стерильный одноразовый фильтр с мембраной PES	ThermoFisher Scientific	568-0010
Коллагеназа IV типа	Сигма-Олдрич	С5138
Планшеты для культивирования тканей 3,5 см	Нунклон	153066
Планшеты для культивирования тканей 10 см	Научный центр Фишера	Тел.: 08-772-22
Центрифужная пробирка 15 мл	Научный центр Фишера	14-959-70С
1X Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Термо Сайентиал	SH3026802
Центрифужная пробирка объемом 50 мл	Научный центр Фишера	14-959-49А
Клеточный фильтр 70 мкМ	Научный центр Фишера	Тел.: 22-363-548
70% этанол	Сигма Олдрич	Е7023	Разбавить до 70% деионизионной водой
инкубатор			Должен быть способен выдерживать 5%CO2 и 37 °C
щипцы	Робоз	РС-8100
центрифуга	любой	любой	Должен выдерживать 125 x g и 300 x g
Дистиллированная вода	любой	любой
Эластаза	MP Biomedicals	100617